Autor Cocer Peptides          prije 26 dana.

Abstract

Kvantitativni rezultat peptida zahtijeva definiranu hemijsku vrstu, odgovarajuću osnovu za kalibraciju i dokaz da rukovanje uzorkom čuva količinu koja se mjeri. Masa praha, postotak hromatografske površine i koncentracija ciljnog peptida opisuju različita svojstva. Ako ih tretirate kao zamjenjive, može doći do greške prije nego što se izvrši prvo mjerenje. Ovaj članak ispituje analizu aminokiselina, ultraljubičastu apsorpciju, kalibriranu tečnu hromatografiju, masenu spektrometriju razblaženja izotopa i kvantitativnu nuklearnu magnetnu rezonancu kao pristupe kvantifikaciji peptida. Objašnjava informacije koje svaka metoda pruža, pretpostavke potrebne za pretvaranje njenog signala u iznos i kontrole potrebne za interpretabilan rezultat. Diskusija se odnosi na laboratorijske materijale i analitička rješenja. On pruža okvir za odabir i procjenu postupka mjerenja, bez propisivanja univerzalnih uslova rada ili granica prihvatljivosti.

Definirajte količinu koja se mjeri

Navedite mjernu veličinu, što znači količinu koja se namjerava mjeriti, prije nego što odaberete instrument. Primjeri uključuju količinu intaktnog peptida u alikvotu, njegovu masenu koncentraciju u pripremljenom rastvoru ili njegov maseni udio u čvrstom uzorku kako je primljen. Identifikujte sekvencu, grupe terminala i relevantne modifikacije. Navedite da li navedena masa uključuje protujone ili opisuje samo peptidni dio. Za rezultat je također potrebna definirana granica uzorka: otopljeni dio, cijeli preparat ili materijal koji se obnavlja nakon određene operacije.

Izvagana čvrsta supstanca može sadržavati vodu, protujone, zaostale rastvarače i druge komponente. Veliki ciljni pik na ultraljubičastom hromatogramu ne mjeri sve ove sastojke. Wang i kolege su demonstrirali pristup ravnoteže mase koji je kombinovao mjerenja nekoliko klasa nečistoća kako bi okarakterizirao sintetički peptidni materijal. Ovo ilustruje zašto se postotak hromatografske površine ne može automatski zamijeniti za maseni udio peptida kada se priprema kvantitativni standard. [1]

Uspostavite osnovu za kalibraciju

Kalibratoru je potrebna određena veličina koja odgovara mjerenju, zajedno sa njegovom nesigurnošću i uslovima pod kojima se taj dodjela primjenjuje. Provjerite certifikat za tačnu seriju, hemijski oblik, osnovu vrijednosti i upute za rukovanje. Oznaka koja navodi hromatografsku čistoću sama po sebi ne daje ciljnu koncentraciju. Bunk i Lowenthal opisuju upotrebu analize aminokiselina razblaženih izotopa na NIST-u da podrže dodjelu koncentracije za referentne materijale za peptide i proteine. Ovakav zadatak zahtijeva dokumentiranu proceduru mjerenja, a ne nominalnu težinu praha. [2]

Za otopinu pripremljenu kvantitativno od materijala s utvrđenim ciljnim masenim udjelom, masena koncentracija je:

ρ = m × w / V

Ovdje je m masa izvaganog materijala, w je njegov ciljni maseni udio peptida na istoj osnovi, a V je konačni volumen otopine. Ako je m u miligramima, w u miligramima po miligramu i V u mililitrima, ρ je u miligramima po mililitru. Kalkulacija pretpostavlja potpuno otapanje i transfer. Ne provjerava te operacije. Pretvorba u koncentraciju količine zahtijeva molarnu masu eksplicitno definirane kemijske vrste.

Pripremite nezavisno rješenje za provjeru kada je to izvodljivo. Standardi za kalibraciju i provjere izvedene iz jedne pogrešno dodijeljene zalihe mogu se slagati jedni s drugima dok nose istu grešku. Sačuvajte zapise o pripremi zaliha i razrjeđivanju kako bi se izvor svake dodijeljene koncentracije mogao rekonstruirati.

Odaberite metodu sa odgovarajućom hemijskom selektivnošću

Odabrati metodu prema sastavu uzorka, očekivanoj koncentraciji i nesigurnosti potrebne za eksperiment. Relativno čist referentni materijal i mješavina koja sadrži nekoliko srodnih peptida predstavljaju različite probleme mjerenja. Tabela 1 upoređuje glavne opcije o kojima se govori u nastavku. Ograničavajuće pitanje je da li se izmjereni odgovor može pripisati definiranom cilju s dovoljno povjerenja.

Tabela 1 Opcije mjerenja i njihova glavna ograničenja

Povežite mjerenja aminokiselina s količinom peptida

Analiza aminokiselina prvo pretvara peptid u mjerljive sastavne aminokiseline. Za ostatak koji se pojavljuje ν _i puta u sekvenci, uočena količina n _i bi odgovarala količini peptida n _i / ν _i ako je oslobađanje bilo potpuno i nijedan drugi izvor nije doprinio toj aminokiselini. Uporedite procjene iz nekoliko odgovarajućih ostataka gdje to sekvenca dopušta. Neslaganje može otkriti problem koji bi prosječenje inače prikrilo.

Hidroliza mora osloboditi odabrane ostatke bez neprihvatljivog gubitka ili konverzije izmjerenih aminokiselina. Bunk i Lowenthal naglašavaju da ovi uslovi zahtijevaju validaciju za svaki analit. Muñoz i kolege su procijenili nekoliko aminokiselina kada su kvantificirali proteinske kalibrane razrjeđivanjem izotopa, dajući eksperimentalni primjer korištenja slaganja između procjena baziranih na ostacima za procjenu hidrolize. Uslove uspostavljene za jedan materijal ne treba pretpostaviti adekvatnim za drugi peptid. [2,3]

Slobodne aminokiseline i drugi peptidi mogu doprinijeti hidrolizatu. Shodno tome, sama analiza aminokiselina može utvrditi ukupan sadržaj vezan za sastav bez selektivne kvantifikacije željene intaktne sekvence. Uključite odgovarajuće uzorke za hidrolizu i istražite ove doprinose prije dodjeljivanja ciljne vrijednosti. Koristite hemijski identitet i oblik slobodne aminokiseline kada izračunavate količine kalibratora. Na primjer, PubChem identificira glicin kao CID 750; zapis baze podataka podržava provjeru identiteta, ali ne potvrđuje sadržaj referentnog materijala aminokiselina. [4]

Interpretirajte ultraljubičasta mjerenja kroz sekvencu

Za homogenu otopinu unutar odgovarajućeg instrumentalnog raspona, Beer-Lambertova veza A = εlc povezuje apsorpciju A korigiranu na slijepo svjetlo s molarnom apsorpcijom ε, dužinom optičkog puta l i koncentracijom količine c. Apsorptivnost mora odgovarati peptidu, talasnoj dužini i uslovima merenja. Apsorbanca blizu 280 nm snažno zavisi od aromatičnih ostataka i ne može poslužiti kao opšte merenje koncentracije za svaki peptid. Anthis i Clore razvili su pristup baziran na sekvenci na 205 nm, pokazujući vrijednost uzimanja u obzir kompozicije umjesto primjene jednog faktora konverzije. [5]

Na kraćim talasnim dužinama, apsorpcija rastvarača i pufera može postati ograničavajuća. Upotrijebite blanko usklađenu kompoziciju, provjerite upotrebljivi optički raspon i uporedite odgovarajuća razrjeđenja. Zamućenje ili apsorbirajuća nečistoća mogu proizvesti prividnu promjenu koncentracije koja nije povezana s metom. Direktan rezultat apsorpcije stoga treba da nosi pretpostavke o sastavu uzorka od kojeg zavisi.

Kromatografsko odvajanje može poboljšati selektivnost prije UV mjerenja, ali kvantitativni LC test i dalje zahtijeva odgovarajući odnos odgovora. Kuipers i Gruppen izmjerili su različite doprinose aminokiselina i peptidnih veza apsorbanciji na 214 nm. Njihovi nalazi objašnjavaju zašto jednake površine vrhova različitih peptida ne moraju predstavljati jednake količine. Za kvantifikaciju cilja, uporedite razrešeni ciljni odgovor sa odgovarajućim dodeljenim standardima i proverite kalibraciju pod stvarnim analitičkim uslovima. [6]

Procijenite interni standard u razrjeđivanju izotopa LC–MS

U LC–MS razblaženju izotopa, odgovor cilja se poredi sa odgovorom dodanog izotopski obeleženog dvojnika kroz definisani kalibracioni model. Potvrdite identitet, dodijeljenu količinu i izotopski sastav tog standarda. Ispitati hromatografsku korespondenciju, relevantne jonske kanale i mogući doprinos neobilježenog materijala ciljnom kanalu. Stojanov i kolege su ilustrovali kako neobračunata heterogenost u unutrašnjim standardima peptida može uticati na rezultirajuću ciljnu koncentraciju. Samo označavanje ne uspostavlja pouzdanu kvantitativnu referencu. [7]

Dodajte interni standard u fazi koja odgovara gubicima koje treba pratiti i utvrdite da se ponaša dovoljno kao analit. Standard uveden nakon ekstrakcije ne može ispraviti gubitke koji su nastali tokom te ekstrakcije. Čak i rano dodavanje zahteva adekvatno mešanje i uporedivo ponašanje. Zadržite i apsolutne odgovore i njihov omjer: stabilan omjer može sakriti velike promjene u osjetljivosti ili rukovanju uzorkom koje zaslužuju istraživanje.

Odaberite prelaze ili signale ekstrahovanih jona koji su vidljivo prikladni za metu u matrici uzorka. Odgovarajuća vrijednost mase do naboja nije, sama po sebi, dokaz da komponenta koja interferira odsutna. Rezultat netaknutog peptida također ne bi trebao biti pretvoren u koncentraciju roditeljskog proteina bez odvojenog uspostavljanja odnosa probave i oporavka.

Koristite kvantitativni NMR sa dodeljenim signalima i referencama

Kvantitativni protonski NMR povezuje integrisani signal dodijeljene rezonancije sa brojem jezgri koji doprinose i kvantitativnom referencom. Za eksperiment interne reference, odnos količine može se izraziti kao:

n _x = n _r × ( I _x / N _x ) / ( I _r / N _r )

Indeksi x i r označavaju analit i referencu. I je integrirani signal, a N broj protona predstavljenih tim signalom; n _r je dodijeljena količina reference. Izraz pretpostavlja kvantitativno uporediv odziv signala i ispravnu dodjelu pikova. Za pretvaranje rezultata u peptidnu masu potrebna je molarna masa na navedenoj osnovi za izvještavanje.

Li i kolege su uporedili qNMR, analizu aminokiselina i kalibrirani HPLC u zajedničkoj studiji peptidnog referentnog materijala. Rad je pokazao praktičnu upotrebu qNMR i takođe pokazao da poređenja metoda zavise od toga kako se tretiraju standardi i nesigurnosti. Njegovi nalazi ne uspostavljaju univerzalni rang za sve uzorke peptida. [8]

Odvojite odabrani analit i referentne signale od nečistoća, rastvarača i međusobno. Uspostavite odgovarajuće pulsne i relaksacijske uslove, signal-šum i granice integracije. BIPM smjernice objašnjavaju zašto se relaksacija mora procijeniti za signale u stvarnoj mješavini. Referenca hemijskog pomaka nije automatski kvantitativni standard. Usko povezane nečistoće koje dijele integriranu rezonanciju mogu doprinijeti izmjerenoj količini čak i kada je integral vrlo ponovljiv. [9]

8 Demonstrirajte raspon kalibracije

Pripremite nivoe kalibracije koji pokrivaju predviđeni odgovor uzorka i procijenite odabrani model odgovora. Ispitajte ostatke i koncentracije izračunate na osnovu krive. Visok koeficijent determinacije, R², ne može sam po sebi uspostaviti prihvatljivu kalibraciju, posebno blizu donjeg kraja raspona. Eurachem preporučuje procjenu ponašanja regresije i razmatranje ponderiranja gdje se varijansa odgovora mijenja s koncentracijom. Odaberite model koristeći eksperimentalne dokaze, a ne izgled iscrtane linije. [10]

Koristite nezavisno pripremljene kontrole za procjenu performansi unutar raspona. Uspostaviti najnižu koncentraciju pri kojoj se može podržati potrebna preciznost i pristranost; samo otkrivanje signala nije dovoljno. Za uzorke koji zahtijevaju razrjeđivanje, pokažite da razrjeđivanje čuva valjan rezultat. Zabilježite kriterije prihvatljivosti prije procjene sekvence uzorka i zadržite razlog za bilo koju isključenu tačku kalibracije. Primijenite kriterije koji odgovaraju analitičkom cilju, bez uvoza brojčanih ograničenja iz nepovezanog testa.

Odvojite gubitke pri rukovanju od efekata matrice

Procijenite otapanje, transfere i periode zadržavanja u koncentracijama korištenim za mjerenje. Goebel-Stengel i kolege su pokazali da oporavak peptida može ovisiti o površini u kontaktu. Nezavisne pripreme uzorka pomažu u otkrivanju ovog doprinosa, dok ponovljena mjerenja instrumenta iz iste bočice ne mogu reproducirati raniji gubitak pripreme. Uporedite odgovarajuće svježe i zadržane alikvote i istražite oporavak nakon bilo kakvog filtriranja ili čišćenja. [11]

Za LC–MS, promjena u odgovoru može odražavati promjenu jonizacije uzrokovanu koeluiranim sastojcima uzorka. Matuszewski i kolege opisali su eksperimente koji razlikuju matrične efekte od oporavka ekstrakcije. Primijenjeno na peptidnu metodu, poređenja između čistih standarda, slijepih ekstrakata obogaćenih nakon ekstrakcije i uzoraka obogaćenih prije ekstrakcije mogu pomoći u razdvajanju ovih utjecaja, pod uvjetom da se koncentracijama, zapreminama i endogenim doprinosima rukuje dosljedno. Procijenite interni standard-normalizirani odgovor kao i pojedinačne signale. [12]

Uključite prazna polja koja odgovaraju na određena pitanja. Prazan reagens ispituje uvedenu pozadinu; slijepa proba nakon koncentriranog uzorka ispituje prijenos. Kada zaista prazna matrica uzorka nije dostupna, dokumentirajte alternativni dizajn i njegova ograničenja. Eksperiment sa šiljcima procjenjuje oporavak dodanog materijala u testiranim uvjetima; ne dokazuje da je izvorno prisutni analit u potpunosti pronađen ili bez smetnji.

Izvještaj o rezultatu s njegovom nesigurnošću i opsegom

Procjena nesigurnosti treba da prati model mjerenja i da uključuje uticajne doprinose. Oni mogu proizaći iz dodjele vrijednosti kalibratora, vaganja i razrjeđivanja, oporavka preparata, kalibracije i ponovljivosti. Uzmite u obzir zajedničke inpute i korelacije gdje je relevantno. JCGM Vodič za izražavanje nesigurnosti u mjerenju pruža okvir za kombinovanje takvih informacija i izvještavanje o rezultatu. Mala standardna devijacija od ponovljenih mjerenja opisuje samo varijaciju predstavljenu tim mjerenjima. [13]

Navedite identifikatore uzorka i serije, definisane vrste peptida, izmjerenu količinu, jedinicu, verziju metode i osnovu kalibracije. Navedite broj i vrstu nezavisnih preparata i kako je primijenjena bilo kakva korekcija razrjeđivanja ili obnavljanja. Ako je prijavljena proširena nesigurnost, identificirajte faktor pokrivenosti i tumačenje koje je opravdano evaluacijom. Sačuvati osnovne hromatograme ili spektre, odluke o integraciji i rezultate kontrole.

Kada se metode ne slažu, prvo uporedite njihovu hemijsku selektivnost i osnove izvještavanja. Procena zasnovana na hidrolizatu, test razrešenog intaktnog peptida i masa praha mogu se odnositi na različite količine. Razriješite tu razliku prije nego što pripišete neslaganje performansama instrumenta. Koristan rezultat je količina vezana za definisani uzorak i podržana eksperimentalnim zapisom koji se može pratiti.

Obim istraživanja. Ovaj članak se bavi analitičkom kvantifikacijom peptidnih materijala u laboratorijskim uzorcima. Ne daje uputstva za upotrebu kod ljudi ili veterinara i ne tvrdi o biološkoj efikasnosti, kliničkoj podobnosti ili regulatornom odobrenju. Svaki postupak mjerenja zahtijeva procjenu predviđenog uzorka i laboratorijskog cilja.

Reference

[1] Wang X, Zhang F, Li H, et al. Određivanje čistoće sintetičkog glukagona korištenjem pristupa ravnoteže mase. Scientific Reports. 2020;10:4423. doi: 10.1038/s41598-020-61109-9

[2] Bunk DM, Lowenthal MS. Izotopska diluciona tečna hromatografija-tandem masena spektrometrija za kvantitativnu analizu aminokiselina. U: Analiza aminokiselina: metode i protokoli. 2nd ed. Metode u molekularnoj biologiji. 2019;2030. Poglavlje 12. doi: 10.1007/978-1-4939-9639-1_12

[3] Muñoz A, Kral R, Schimmel H. Kvantifikacija proteinskih kalibranata analizom aminokiselina upotrebom masene spektrometrije razblaženja izotopa. Analytical Biochemistry. 2011;408(1):124–131. doi: 10.1016/j.ab.2010.08.037

[4] Nacionalni centar za biotehnološke informacije. PubChem Compound Rezime za CID 750, Glycine. Pristupljeno 2. novembra 2026. Izvorni dokument

[5] Anthis NJ, Clore GM. Određivanje koncentracija proteina i peptida na 205 nm upijanjem na 205 nm specifično za sekvencu. Protein Science. 2013;22(6):851–858. doi: 10.1002/pro.2253

[6] Kuipers BJH, Gruppen H. Predviđanje koeficijenata molarne ekstinkcije proteina i peptida korištenjem UV apsorpcije sastavnih aminokiselina na 214 nm kako bi se omogućila kvantitativna analiza reverzne faze tečnom hromatografijom i masenom spektrometrijom visokih performansi. Časopis za poljoprivrednu i prehrambenu hemiju. 2007;55(14):5445–5451. doi: 10.1021/jf070337l

[7] Stoyanov AV, Rogatsky E, Stein D, et al. Test razblaživanja izotopa u kvantificiranju peptida: Izazov mikroheterogenosti internog standarda. Kliničke primjene proteomike. 2013;7(11–12):825–828. doi: 10.1002/prca.201200130

[8] Li C, Bhavaraju S, Melanson JE, et al. Istraživanje metoda kvantifikacije peptida i poređenje njihove reproduktivnosti: Studija slučaja korištenjem oksitocina. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2019;166:105–112. doi: 10.1016/j.jpba.2018.12.028

[9] Westwood S, Stoppacher N, Martos G, et al. Interni standardni referentni podaci za qNMR: 3,5-bis(trifluorometil)benzojeva kiselina. Izvještaj BIPM-2019/02, ISRD-05. Verzija 1.0; 13. mart 2019. Odjeljak 3. Izvorni dokument

[10] Cantwell H, ur. Prikladnost analitičkih metoda za svrhu: Laboratorijski vodič za validaciju metoda i srodne teme. 3rd ed. Eurachem; 2025. Odjeljci 5.2–5.4. Izvorni dokument

[11] Goebel-Stengel M, Stengel A, Taché Y, Reeve JR Jr. Važnost upotrebe optimalnog plastičnog i staklenog posuđa u studijama koje uključuju peptide. Analytical Biochemistry. 2011;414(1):38–46. doi: 10.1016/j.ab.2011.02.009

[12] Matuszewski BK, Constanzer ML, Chavez-Eng CM. Strategije za procjenu efekta matriksa u kvantitativnim bioanalitičkim metodama zasnovanim na HPLC-MS/MS. Analytical Chemistry. 2003;75(13):3019–3030. doi: 10.1021/ac020361s

[13] Zajednički komitet za vodiče u mjeriteljstvu. Evaluacija mjernih podataka: Vodič za izražavanje nesigurnosti u mjerenju. JCGM 100:2008. Ispravljena verzija 2010. Odjeljci 4–7. Izvorni dokument

SVI ČLANCI I INFORMACIJE O PROIZVODU DANE NA OVOM WEB SAJTU SU ISKLJUČIVO ZA ŠIRENJE INFORMACIJA I EDUKATIVNE SVRHE.

Proizvodi koji se nalaze na ovoj web stranici namijenjeni su isključivo za in vitro istraživanja. In vitro istraživanja (latinski: *u staklu*, što znači u staklenom posuđu) se provode izvan ljudskog tijela. Ovi proizvodi nisu farmaceutski proizvodi, nisu odobreni od strane US Food and Drug Administration (FDA) i ne smiju se koristiti za prevenciju, liječenje ili liječenje bilo kojeg medicinskog stanja, bolesti ili bolesti. Zakonom je strogo zabranjeno unošenje ovih proizvoda u ljudsko ili životinjsko tijelo u bilo kojem obliku.