Oleh Cocer Peptides          26 hari yang lalu.

Abstrak

Keputusan peptida kuantitatif memerlukan spesies kimia yang ditentukan, asas penentukuran yang sesuai dan bukti bahawa pengendalian sampel mengekalkan kuantiti yang diukur. Jisim serbuk, peratusan luas kromatografi dan kepekatan peptida sasaran menerangkan sifat yang berbeza. Melayan mereka sebagai boleh ditukar ganti boleh menyebabkan ralat sebelum pengukuran pertama dibuat. Artikel ini mengkaji analisis asid amino, penyerapan ultraungu, kromatografi cecair yang ditentukur, spektrometri jisim pencairan isotop dan resonans magnet nuklear kuantitatif sebagai pendekatan kepada kuantifikasi peptida. Ia menerangkan maklumat yang disediakan oleh setiap kaedah, andaian yang diperlukan untuk menukar isyaratnya kepada jumlah, dan kawalan yang diperlukan untuk hasil yang boleh ditafsir. Perbincangan berkenaan bahan makmal dan penyelesaian analisis. Ia menyediakan rangka kerja untuk memilih dan menilai prosedur pengukuran, tanpa menetapkan syarat operasi universal atau had penerimaan.

Tentukan kuantiti yang hendak diukur

Nyatakan sukatan, bermaksud kuantiti yang ingin diukur, sebelum memilih instrumen. Contohnya termasuk jumlah peptida utuh dalam aliquot, kepekatan jisimnya dalam larutan yang disediakan, atau pecahan jisimnya dalam sampel pepejal seperti yang diterima. Kenal pasti urutan, kumpulan terminal dan pengubahsuaian yang berkaitan. Nyatakan sama ada jisim yang dilaporkan termasuk pembilang atau menerangkan bahagian peptida sahaja. Hasilnya juga memerlukan sempadan sampel yang ditentukan: bahagian terlarut, keseluruhan penyediaan atau bahan yang diperoleh semula selepas operasi tertentu.

Pepejal yang ditimbang boleh mengandungi air, pembilang, sisa pelarut dan komponen lain. Puncak sasaran yang besar dalam kromatogram ultraviolet tidak mengukur semua juzuk ini. Wang dan rakan sekerja menunjukkan pendekatan pengimbangan jisim yang menggabungkan pengukuran beberapa kelas kekotoran untuk mencirikan bahan peptida sintetik. Ini menggambarkan mengapa peratusan luas kromatografi tidak boleh digantikan secara automatik untuk pecahan jisim peptida apabila menyediakan piawaian kuantitatif. [1]

Wujudkan asas penentukuran

Penentukuran memerlukan kuantiti yang ditetapkan yang sesuai dengan pengukuran, bersama-sama dengan ketidakpastiannya dan keadaan di mana penetapan itu terpakai. Semak sijil untuk mendapatkan lot yang tepat, bentuk kimia, asas nilai dan arahan pengendalian. Label yang menyatakan ketulenan kromatografi sahaja tidak membekalkan kepekatan sasaran. Bunk dan Lowenthal menerangkan penggunaan analisis asid amino pencairan isotop di NIST untuk menyokong penugasan kepekatan untuk bahan rujukan peptida dan protein. Tugasan sedemikian memerlukan prosedur pengukuran yang didokumenkan, bukannya berat serbuk nominal. [2]

Untuk penyelesaian yang disediakan secara kuantitatif daripada bahan dengan pecahan jisim sasaran yang ditetapkan, kepekatan jisim ialah:

ρ = m × w / V

Di sini, m ialah jisim bahan yang ditimbang, w ialah pecahan jisim peptida sasarannya pada asas yang sama, dan V ialah isipadu penyelesaian akhir. Jika m dalam miligram, w dalam miligram per miligram dan V dalam mililiter, ρ adalah dalam miligram per mililiter. Pengiraan menganggap pembubaran dan pemindahan lengkap. Ia tidak mengesahkan operasi tersebut. Penukaran kepada kepekatan amaun memerlukan jisim molar spesies kimia yang ditakrifkan dengan jelas.

Sediakan penyelesaian cek bebas apabila boleh. Piawaian penentukuran dan semakan yang diperoleh daripada satu stok yang ditetapkan secara salah boleh bersetuju antara satu sama lain sambil membawa ralat yang sama. Simpan rekod penyediaan dan pencairan stok supaya punca setiap kepekatan yang ditetapkan boleh dibina semula.

Pilih kaedah dengan selektiviti kimia yang mencukupi

Pilih kaedah mengikut komposisi sampel, jangkaan kepekatan dan ketidakpastian yang diperlukan untuk eksperimen. Bahan rujukan yang agak tulen dan campuran yang mengandungi beberapa peptida berkaitan menimbulkan masalah pengukuran yang berbeza. Jadual 1 membandingkan pilihan utama yang dibincangkan di bawah. Soalan mengehadkan ialah sama ada respons yang diukur boleh dikaitkan dengan sasaran yang ditentukan dengan keyakinan yang mencukupi.

Jadual 1 Pilihan pengukuran dan had utamanya

Kaitkan ukuran asid amino dengan jumlah peptida

Analisis asid amino mula-mula menukar peptida kepada asid amino juzuk yang boleh diukur. Untuk sisa yang berlaku ν _i kali dalam jujukan, jumlah yang diperhatikan n _i akan sepadan dengan jumlah peptida n _i / ν _i jika pelepasan telah lengkap dan tiada sumber lain menyumbang asid amino tersebut. Bandingkan anggaran daripada beberapa sisa yang sesuai di mana jujukan membenarkan. Perselisihan faham boleh mendedahkan masalah yang sebaliknya akan disembunyikan oleh purata.

Hidrolisis mesti membebaskan sisa terpilih tanpa kehilangan atau penukaran asid amino yang tidak boleh diterima. Bunk dan Lowenthal menekankan bahawa syarat ini memerlukan pengesahan untuk setiap analit. Muñoz dan rakan sekerja menilai beberapa asid amino apabila mengukur kalibran protein dengan pencairan isotop, memberikan contoh eksperimen menggunakan persetujuan antara anggaran berasaskan sisa untuk menilai hidrolisis. Keadaan yang ditetapkan untuk satu bahan tidak boleh diandaikan mencukupi untuk peptida yang berbeza. [2,3]

Asid amino bebas dan peptida lain boleh menyumbang kepada hidrolisat. Akibatnya, analisis asid amino sahaja boleh mewujudkan jumlah kandungan berkaitan komposisi tanpa mengira secara selektif urutan utuh yang dimaksudkan. Sertakan tempat kosong hidrolisis yang sesuai dan siasat sumbangan ini sebelum memberikan nilai sasaran. Gunakan identiti kimia dan bentuk asid amino bebas semasa mengira jumlah penentukur. Sebagai contoh, PubChem mengenal pasti glisin sebagai CID 750; rekod pangkalan data menyokong semakan identiti tetapi tidak memperakui kandungan bahan rujukan asid amino. [4]

Mentafsir ukuran ultraungu melalui jujukan

Untuk penyelesaian homogen dalam julat instrumental yang sesuai, hubungan Beer-Lambert A = εlc menghubungkan penyerapan A yang diperbetulkan kosong dengan penyerapan molar ε, panjang laluan optik l dan jumlah kepekatan c. Penyerapan mesti sepadan dengan peptida, panjang gelombang dan keadaan pengukuran. Penyerapan berhampiran 280 nm sangat bergantung pada sisa aromatik dan tidak boleh berfungsi sebagai ukuran kepekatan umum untuk setiap peptida. Anthi dan Clore membangunkan pendekatan berasaskan jujukan pada 205 nm, menunjukkan nilai perakaunan untuk komposisi dan bukannya menggunakan faktor penukaran tunggal. [5]

Pada panjang gelombang yang lebih pendek, penyerapan pelarut dan penimbal boleh menjadi terhad. Gunakan kosong yang dipadankan dengan komposisi, semak julat optik yang boleh digunakan dan bandingkan pencairan yang sesuai. Kekeruhan atau kekotoran yang menyerap boleh menghasilkan perubahan kepekatan yang jelas yang tidak berkaitan dengan sasaran. Oleh itu, hasil penyerapan langsung harus membawa andaian tentang komposisi sampel yang bergantung padanya.

Pemisahan kromatografi boleh meningkatkan selektiviti sebelum pengukuran UV, tetapi ujian LC kuantitatif masih memerlukan hubungan tindak balas yang sesuai. Kuipers dan Gruppen mengukur sumbangan asid amino dan ikatan peptida yang berbeza kepada penyerapan pada 214 nm. Penemuan mereka menjelaskan mengapa kawasan puncak yang sama daripada peptida yang berbeza tidak perlu mewakili jumlah yang sama. Untuk kuantifikasi sasaran, bandingkan tindak balas sasaran yang diselesaikan dengan piawaian yang ditetapkan yang sesuai dan sahkan penentukuran di bawah keadaan analisis sebenar. [6]

Menilai piawai dalaman dalam pencairan isotop LC–MS

Dalam pencairan isotop LC-MS, tindak balas sasaran dibandingkan dengan rakan sejawatan berlabel isotop yang ditambah melalui model penentukuran yang ditentukan. Sahkan identiti, jumlah yang ditetapkan dan komposisi isotop piawaian itu. Periksa korespondensi kromatografi, saluran ion yang berkaitan dan kemungkinan sumbangan bahan tidak berlabel kepada saluran sasaran. Stoyanov dan rakan sekerja menggambarkan bagaimana heterogeniti yang tidak dikira dalam piawaian dalaman peptida boleh berat sebelah kepekatan sasaran yang terhasil. Pelabelan sahaja tidak mewujudkan rujukan kuantitatif yang boleh dipercayai. [7]

Tambahkan piawai dalaman pada peringkat yang sesuai dengan kerugian yang ingin dijejaki dan tentukan bahawa ia berkelakuan cukup seperti analit. Piawaian yang diperkenalkan selepas pengekstrakan tidak boleh membetulkan kerugian yang berlaku semasa pengekstrakan itu. Malah penambahan awal memerlukan pencampuran yang mencukupi dan tingkah laku yang setanding. Kekalkan kedua-dua respons mutlak dan nisbahnya: nisbah yang stabil boleh menyembunyikan perubahan besar dalam sensitiviti atau pengendalian sampel yang patut disiasat.

Pilih peralihan atau isyarat ion yang diekstrak yang sesuai ditunjukkan untuk sasaran dalam matriks sampel. Nilai jisim-ke-cas yang sepadan bukanlah, dengan sendirinya, bukti bahawa komponen yang mengganggu tiada. Hasil peptida yang utuh juga tidak boleh ditukar kepada kepekatan protein induk tanpa mewujudkan hubungan pencernaan dan pemulihan secara berasingan.

Gunakan NMR kuantitatif dengan isyarat dan rujukan yang ditetapkan

NMR proton kuantitatif mengaitkan isyarat bersepadu bagi resonans yang ditetapkan kepada bilangan nukleus penyumbang dan rujukan kuantitatif. Untuk percubaan rujukan dalaman, perhubungan amaun boleh dinyatakan sebagai:

n _x = n _r × ( I _x / N _x ) / ( I _r / N _r )

Subskrip x dan r menandakan analit dan rujukan. I ialah isyarat bersepadu dan N bilangan proton yang diwakili oleh isyarat itu; n _r ialah jumlah rujukan yang ditetapkan. Ungkapan ini menganggap tindak balas isyarat setanding secara kuantitatif dan penetapan puncak yang betul. Menukar hasil kepada jisim peptida memerlukan jisim molar pada asas pelaporan yang dinyatakan.

Li dan rakan sekerja membandingkan qNMR, analisis asid amino dan HPLC yang ditentukur dalam kajian kolaboratif bahan rujukan peptida. Kerja ini menunjukkan penggunaan praktikal qNMR dan juga menunjukkan bahawa perbandingan kaedah bergantung pada cara piawaian dan ketidakpastian dirawat. Penemuannya tidak menetapkan kedudukan universal untuk semua sampel peptida. [8]

Selesaikan analit yang dipilih dan isyarat rujukan daripada bendasing, pelarut dan satu sama lain. Wujudkan keadaan nadi dan kelonggaran yang sesuai, isyarat-ke-bunyi dan sempadan penyepaduan. Panduan BIPM menerangkan mengapa kelonggaran mesti dinilai untuk isyarat dalam campuran sebenar. Rujukan anjakan kimia bukanlah piawaian kuantitatif secara automatik. Kekotoran berkait rapat berkongsi resonans bersepadu boleh menyumbang kepada jumlah yang diukur walaupun kamiran sangat boleh berulang. [9]

8 Tunjukkan julat penentukuran

Sediakan tahap penentukuran yang meliputi tindak balas sampel yang dimaksudkan dan menilai model tindak balas yang dipilih. Periksa baki dan kepekatan yang dikira kembali dari lengkung. Pekali penentuan yang tinggi, R², tidak boleh dengan sendirinya mewujudkan penentukuran yang boleh diterima, terutamanya berhampiran hujung bawah julat. Eurachem mengesyorkan menilai tingkah laku regresi dan mempertimbangkan pemberatan apabila varians tindak balas berubah mengikut kepekatan. Pilih model menggunakan bukti eksperimen dan bukannya penampilan garis yang diplot. [10]

Gunakan kawalan yang disediakan secara bebas untuk menilai prestasi dalam julat. Wujudkan kepekatan terendah di mana ketepatan dan berat sebelah yang diperlukan boleh disokong; pengesanan isyarat sahaja tidak mencukupi. Untuk sampel yang memerlukan pencairan, tunjukkan bahawa pencairan mengekalkan hasil yang sah. Catatkan kriteria penerimaan sebelum menilai jujukan sampel dan kekalkan sebab untuk sebarang titik penentukuran yang dikecualikan. Gunakan kriteria yang sesuai dengan objektif analisis, tanpa mengimport had berangka daripada ujian yang tidak berkaitan.

Asingkan kerugian pengendalian daripada kesan matriks

Nilaikan tempoh pembubaran, pemindahan dan pegangan pada kepekatan yang digunakan untuk pengukuran. Goebel-Stengel dan rakan sekerja menunjukkan bahawa pemulihan peptida boleh bergantung pada permukaan yang dihubungi. Persediaan sampel bebas membantu mendedahkan sumbangan ini, manakala pengukuran instrumen berulang dari vial yang sama tidak boleh menghasilkan semula kehilangan penyediaan lebih awal. Bandingkan aliquot segar dan dipegang yang sesuai dan siasat pemulihan selepas sebarang penapisan atau pembersihan. [11]

Untuk LC-MS, perubahan tindak balas boleh mencerminkan perubahan dalam pengionan yang disebabkan oleh penggabungan juzuk sampel. Matuszewski dan rakan sekerja menerangkan eksperimen yang membezakan kesan matriks daripada pemulihan pengekstrakan. Digunakan pada kaedah peptida, perbandingan antara piawaian yang kemas, ekstrak kosong yang diperkaya selepas pengekstrakan dan sampel yang diperkuat sebelum pengekstrakan boleh membantu memisahkan pengaruh ini, dengan syarat kepekatan, isipadu dan sumbangan endogen dikendalikan secara konsisten. Nilaikan tindak balas ternormal-standard dalaman serta isyarat individu. [12]

Sertakan tempat kosong yang menjawab soalan tertentu. Reagen kosong meneliti latar belakang yang diperkenalkan; kosong selepas sampel pekat meneliti pemindahan. Jika matriks sampel yang benar-benar kosong tidak tersedia, dokumen reka bentuk alternatif dan hadnya. Percubaan spike menilai pemulihan bahan tambahan di bawah keadaan yang diuji; ia tidak membuktikan bahawa analit yang sedia ada telah pulih sepenuhnya atau bebas daripada gangguan.

Laporkan hasilnya dengan ketidakpastian dan skopnya

Penilaian ketidakpastian harus mengikut model pengukuran dan termasuk sumbangan yang berpengaruh. Ini boleh timbul daripada penentuan nilai penentukuran, penimbangan dan pencairan, pemulihan penyediaan, penentukuran dan kebolehulangan. Ambil kira input dan korelasi yang dikongsi jika berkaitan. Panduan JCGM untuk Ungkapan Ketidakpastian dalam Pengukuran menyediakan rangka kerja untuk menggabungkan maklumat tersebut dan melaporkan hasilnya. Sisihan piawai yang kecil daripada pengukuran berulang menerangkan hanya variasi yang diwakili oleh ukuran tersebut. [13]

Laporkan sampel dan pengecam kelompok, spesies peptida yang ditentukan, kuantiti yang diukur, unit, versi kaedah dan asas penentukuran. Nyatakan bilangan dan jenis sediaan bebas dan cara sebarang pencairan atau pembetulan pemulihan digunakan. Jika ketidakpastian berkembang dilaporkan, kenal pasti faktor liputan dan tafsiran yang dibenarkan oleh penilaian. Kekalkan kromatogram atau spektrum asas, keputusan penyepaduan dan keputusan kawalan.

Apabila kaedah tidak bersetuju, mula-mula bandingkan selektiviti kimia dan asas pelaporan mereka. Anggaran berasaskan hidrolisat, ujian peptida utuh yang diselesaikan dan jisim serbuk boleh merujuk kepada kuantiti yang berbeza. Selesaikan perbezaan itu sebelum mengaitkan ketidaksetujuan kepada prestasi instrumen. Hasil yang berguna ialah kuantiti yang terikat pada sampel yang ditentukan dan disokong oleh rekod percubaan yang boleh dikesan.

Skop penyelidikan. Artikel ini melibatkan kuantifikasi analitik bahan peptida dalam sampel makmal. Ia tidak memberikan arahan untuk kegunaan manusia atau veterinar dan tidak membuat tuntutan tentang keberkesanan biologi, kesesuaian klinikal atau kelulusan kawal selia. Setiap prosedur pengukuran memerlukan penilaian untuk sampel yang dimaksudkan dan objektif makmal.

Rujukan

[1] Wang X, Zhang F, Li H, et al. Penentuan ketulenan glukagon sintetik menggunakan pendekatan keseimbangan jisim. Laporan Saintifik. 2020;10:4423. doi: 10.1038/s41598-020-61109-9

[2] DM dua tingkat, MS Lowenthal. Kromatografi cecair pencairan isotop-spektrometri jisim tandem untuk analisis asid amino kuantitatif. Dalam: Analisis Asid Amino: Kaedah dan Protokol. ed ke-2. Kaedah dalam Biologi Molekul. 2019;2030. Bab 12. doi: 10.1007/978-1-4939-9639-1_12

[3] Muñoz A, Kral R, Schimmel H. Kuantifikasi penentukuran protein oleh analisis asid amino menggunakan spektrometri jisim pencairan isotop. Biokimia Analitik. 2011;408(1):124–131. doi: 10.1016/j.ab.2010.08.037

[4] Pusat Maklumat Bioteknologi Kebangsaan. Ringkasan Kompaun PubChem untuk CID 750, Glycine. Diakses pada 2 November 2026. Dokumen sumber

[5] Anthis NJ, Clore GM. Penentuan khusus jujukan kepekatan protein dan peptida dengan penyerapan pada 205 nm. Sains Protein. 2013;22(6):851–858. doi: 10.1002/pro.2253

[6] Kuipers BJH, Gruppen H. Ramalan pekali kepupusan molar protein dan peptida menggunakan penyerapan UV bagi asid amino juzuk pada 214 nm untuk membolehkan analisis kromatografi cecair berprestasi tinggi-spektrometri jisim fasa songsang kuantitatif. Jurnal Kimia Pertanian dan Makanan. 2007;55(14):5445–5451. doi: 10.1021/jf070337l

[7] Stoyanov AV, Rogatsky E, Stein D, et al. Ujian pencairan isotop dalam kuantifikasi peptida: Cabaran mikroheterogeniti standard dalaman. Aplikasi Klinikal Proteomik. 2013;7(11–12):825–828. doi: 10.1002/prca.201200130

[8] Li C, Bhavaraju S, Melanson JE, et al. Tinjauan kaedah kuantifikasi peptida dan perbandingan kebolehulangannya: Kajian kes menggunakan oxytocin. Jurnal Analisis Farmaseutikal dan Bioperubatan. 2019;166:105–112. doi: 10.1016/j.jpba.2018.12.028

[9] Westwood S, Stoppacher N, Martos G, et al. Data Rujukan Piawai Dalaman untuk qNMR: 3,5-Bis(trifluoromethyl)benzoic Acid. Rapport BIPM-2019/02, ISRD-05. Versi 1.0; 13 Mac 2019. Seksyen 3. Dokumen sumber

[10] Cantwell H, ed. Kesesuaian untuk Tujuan Kaedah Analisis: Panduan Makmal untuk Pengesahan Kaedah dan Topik Berkaitan. ed ke-3. Eurachem; 2025. Bahagian 5.2–5.4. Dokumen sumber

[11] Goebel-Stengel M, Stengel A, Taché Y, Reeve JR Jr. Kepentingan menggunakan barangan plastik dan kaca yang optimum dalam kajian yang melibatkan peptida. Biokimia Analitik. 2011;414(1):38–46. doi: 10.1016/j.ab.2011.02.009

[12] Matuszewski BK, Constanzer ML, Chavez-Eng CM. Strategi untuk penilaian kesan matriks dalam kaedah bioanalitik kuantitatif berdasarkan HPLC-MS/MS. Kimia Analitik. 2003;75(13):3019–3030. doi: 10.1021/ac020361s

[13] Jawatankuasa Bersama untuk Panduan dalam Metrologi. Penilaian Data Pengukuran: Panduan untuk Ungkapan Ketidakpastian dalam Pengukuran. JCGM 100:2008. Versi diperbetulkan 2010. Bahagian 4–7. Dokumen sumber

SEMUA ARTIKEL DAN MAKLUMAT PRODUK YANG DISEDIAKAN DI LAMAN WEB INI ADALAH SEMATA-MATA UNTUK PENYEDARAN MAKLUMAT DAN TUJUAN PENDIDIKAN.

Produk yang disediakan di laman web ini bertujuan secara eksklusif untuk penyelidikan in vitro. Penyelidikan in vitro (Latin: *dalam kaca*, bermaksud dalam barang kaca) dijalankan di luar badan manusia. Produk ini bukan farmaseutikal, tidak diluluskan oleh Pentadbiran Makanan dan Ubat (FDA) AS, dan tidak boleh digunakan untuk mencegah, merawat atau menyembuhkan sebarang keadaan perubatan, penyakit atau penyakit. Ia dilarang sama sekali oleh undang-undang untuk memperkenalkan produk ini ke dalam badan manusia atau haiwan dalam apa jua bentuk.