にCocer Peptidesにより。 
26日前
定量的なペプチドの結果には、定義された化学種、適切な校正基準、およびサンプルの取り扱いによって測定される量が維持されるという証拠が必要です。粉末の質量、クロマトグラフィーの面積パーセンテージ、およびターゲットペプチドの濃度によって、さまざまな特性が説明されます。これらを交換可能なものとして扱うと、最初の測定が行われる前に誤差が生じる可能性があります。この記事では、ペプチド定量へのアプローチとして、アミノ酸分析、紫外吸光度、校正液体クロマトグラフィー、同位体希釈質量分析法、および定量的核磁気共鳴を検討します。各メソッドが提供する情報、信号を量に変換するために必要な仮定、解釈可能な結果を得るために必要なコントロールについて説明します。議論は実験室の材料と分析ソリューションに関するものです。これは、普遍的な動作条件や許容限界を規定することなく、測定手順を選択および評価するためのフレームワークを提供します。
機器を選択する前に、測定量、つまり測定対象の量を指定します。例には、アリコート中の無傷のペプチドの量、調製された溶液中のその質量濃度、または受け取った固体サンプル中のその質量分率が含まれます。配列、末端基、および関連する修飾を特定します。報告された質量に対イオンが含まれているか、それともペプチド部分のみを説明しているかを述べます。結果には、定義されたサンプル境界 (溶解部分、調製物全体、または指定された操作後に回収された材料) も必要です。
秤量された固体には、水、対イオン、残留溶媒、その他の成分が含まれている可能性があります。紫外クロマトグラム内の大きなターゲット ピークは、これらの成分すべてを測定するわけではありません。 Wangらは、合成ペプチド材料の特性を評価するために、いくつかの不純物クラスの測定を組み合わせた質量平衡アプローチを実証した。これは、定量標準を調製する際に、クロマトグラフィーの面積パーセントをペプチドの質量分率に自動的に置き換えることができない理由を示しています。 [1]
校正器には、測定に適切な割り当て量と、その割り当てが適用される不確かさおよび条件が必要です。正確なロット、化学的形態、価値基準、および取り扱い上の注意事項については、証明書を確認してください。クロマトグラフィー純度を記載したラベルだけでは、目標濃度は得られません。 Bunk と Lowenthal は、NIST でのペプチドおよびタンパク質標準物質の濃度割り当てをサポートするための同位体希釈アミノ酸分析の使用について説明しています。このような割り当てには、公称粉末重量ではなく、文書化された測定手順が必要です。 [2]
確立された目標質量分率を持つ材料から定量的に調製された溶液の場合、質量濃度は次のようになります。
ρ = m × w / V
ここで、m は秤量した材料の質量、w は同じ基準でのそのターゲットペプチド質量分率、V は最終溶液の体積です。 m がミリグラム、w がミリグラム/ミリグラム、V がミリリットルの場合、ρ はミリグラム/ミリリットルです。計算は完全な溶解と移行を前提としています。それらの動作は検証しません。量濃度への変換には、明示的に定義された化学種のモル質量が必要です。
可能な場合は、独立したチェック ソリューションを準備します。誤って割り当てられた 1 つのストックから派生した校正標準とチェックは、同じ誤差を抱えながらも互いに一致する可能性があります。割り当てられたすべての濃度のソースを再構築できるように、ストックの調製と希釈の記録を保存します。
サンプルの組成、予想される濃度、実験に必要な不確実性に応じて方法を選択します。比較的純粋な標準物質と、いくつかの関連ペプチドを含む混合物では、異なる測定上の問題が発生します。表 1 は、以下で説明する主要なオプションを比較しています。限定的な問題は、測定された応答が十分な信頼性を持って定義されたターゲットに起因すると考えられるかどうかです。
表 1 測定オプションとその主な制限事項
方法 |
定量化の根拠 |
調査の限界 |
アミノ酸分析 |
放出されたアミノ酸の量は配列組成に関連します。 |
加水分解の完全性と他のペプチドまたは遊離アミノ酸からの寄与。 |
直接UV吸光度 |
適切な吸光率により吸光度が濃度に関係します。 |
配列依存性、汚染物質の吸収、および光学的バックグラウンド。 |
UV 検出機能を備えた校正済み LC |
割り当てられたペプチド標準と比較したターゲットのピーク応答。 |
未解決の成分と応答またはサンプル回収の違い。 |
同位体希釈LC-MS |
特徴付けられた同位体標識された内部標準と比較した分析物の応答。 |
干渉、マトリックス効果、および内部標準の割り当て量。 |
定量NMR |
核の数と定量的基準に関連する信号積分。 |
信号のオーバーラップ、緩和、基準適合性。 |
アミノ酸分析では、まずペプチドを測定可能な構成アミノ酸に変換します。出現する残基については、 ν i回 配列内で n i は 量 ni ν / iに対応するであろう。ペプチド 放出が完了し、他の供給源がそのアミノ酸に寄与しない場合、観察された量配列が許可するいくつかの適切な残基からの推定値を比較します。意見の不一致により、平均化によって隠蔽されてしまう問題が明らかになる可能性があります。
加水分解では、測定されたアミノ酸が許容できないほど損失または変換されることなく、選択された残基が放出されなければなりません。 Bunk と Lowenthal は、これらの条件では各分析物の検証が必要であることを強調しています。 Muñozらは、同位体希釈によってタンパク質キャリブラントを定量する際にいくつかのアミノ酸を評価し、残基ベースの推定値間の一致を利用して加水分解を評価する実験例を提供した。ある材料に対して確立された条件が、別のペプチドに対して適切であると想定すべきではありません。 [2,3]
遊離アミノ酸および他のペプチドが加水分解物に寄与する可能性があります。したがって、アミノ酸分析だけでは、意図した無傷の配列を選択的に定量することなく、組成に関連する総量を確立できる可能性があります。目標値を割り当てる前に、適切な加水分解ブランクを含めてこれらの寄与を調査してください。キャリブレーターの量を計算するときは、遊離アミノ酸の化学的正体と形態を使用します。たとえば、PubChem はグリシンを CID 750 として識別します。データベース レコードは同一性チェックをサポートしますが、アミノ酸標準物質の内容を証明するものではありません。 [4]
適切な機器範囲内の均一な溶液の場合、ベールとランベルトの関係 A = εlc は、ブランク補正された吸光度 A をモル吸光係数 ε、光路長 l および量濃度 c と結び付けます。吸収率はペプチド、波長、測定条件に対応する必要があります。 280 nm 付近の吸光度は芳香族残基に強く依存するため、すべてのペプチドの一般的な濃度測定として機能することはできません。 Anthis と Clore は 205 nm での配列ベースのアプローチを開発し、単一の変換係数を適用するのではなく組成を考慮することの価値を示しました。 [5]
より短い波長では、溶媒と緩衝液の吸収が制限される可能性があります。組成が一致したブランクを使用し、使用可能な光学範囲を確認し、適切な希釈を比較します。濁りや不純物の吸収により、ターゲットとは無関係に見かけの濃度変化が生じる可能性があります。したがって、直接的な吸光度の結果には、それが依存するサンプル組成に関する仮定が含まれている必要があります。
クロマトグラフィーによる分離は、UV 測定前の選択性を向上させることができますが、定量的 LC アッセイでは依然として適切な応答関係が必要です。カイパースとグルッペンは、214 nm での吸光度に対するアミノ酸とペプチド結合の異なる寄与を測定しました。彼らの発見は、異なるペプチドからの等しいピーク面積が等しい量を表す必要がない理由を説明しています。ターゲットの定量化では、解決されたターゲットの応答を適切に割り当てられた標準と比較し、実際の分析条件下でキャリブレーションを検証します。 [6]
同位体希釈 LC-MS では、定義されたキャリブレーション モデルを通じて、ターゲットの応答が追加された同位体標識された対応物の応答と比較されます。その標準物質の正体、割り当て量、同位体組成を確認します。クロマトグラフィーの対応関係、関連するイオン チャネル、およびターゲット チャネルに対する未標識物質の寄与の可能性を調べます。 Stoyanovらは、ペプチド内部標準における説明のつかない不均一性が、結果として生じる標的濃度にどのような偏りをもたらす可能性があるかを説明した。標識だけでは信頼できる定量的基準は確立されません。 [7]
追跡対象の損失に適した段階で内部標準を追加し、それが検体と十分に同様に動作することを確立します。抽出後に導入された標準では、抽出中に発生した損失を修正することはできません。初期の添加であっても、適切な混合と同等の動作が必要です。絶対応答とその比率の両方を保持します。比率が安定していると、調査に値する感度やサンプル処理の大きな変化が隠蔽される可能性があります。
サンプルマトリックス内のターゲットに明らかに適した遷移または抽出イオンシグナルを選択します。質量対電荷の値が一致すること自体は、干渉成分が存在しないことを証明するものではありません。また、消化と回収の関係を個別に確立することなく、無傷のペプチドの結果を親タンパク質の濃度に変換すべきではありません。
定量的プロトン NMR は、割り当てられた共鳴の積分信号を、寄与する原子核の数および定量的基準に関連付けます。内部参照実験の場合、量の関係は次のように表すことができます。
n x = n r × ( I x / N x ) / ( I r / N r )
下付き文字の x と r は分析物と参照を示します。 I は積分された信号、N はその信号によって表される陽子の数です。 n r は割り当てられた参照量です。この式は、定量的に比較可能な信号応答と正確なピークの割り当てを前提としています。結果をペプチド質量に変換するには、記載されている報告ベースのモル質量が必要です。
Liらは、ペプチド標準物質の共同研究において、qNMR、アミノ酸分析、および校正されたHPLCを比較した。この研究は、qNMR の実際の使用法を実証し、また、方法の比較が標準と不確実性の扱い方に依存することを示しました。その結果は、すべてのペプチドサンプルに対する普遍的なランキングを確立するものではありません。 [8]
不純物、溶媒、および相互から選択した分析物と参照信号を分離します。適切なパルスおよび緩和条件、信号対ノイズおよび積分境界を確立します。 BIPM ガイダンスでは、実際の混合物内の信号に対して緩和を評価する必要がある理由を説明しています。化学シフトの基準は自動的に定量的な基準になるわけではありません。積分値の再現性が高い場合でも、積分共鳴を共有する密接に関連した不純物が測定量に寄与する可能性があります。 [9]
意図したサンプル応答をカバーするキャリブレーション レベルを準備し、選択した応答モデルを評価します。曲線から逆算された残差と濃度を調べます。高い決定係数 R² は、特に範囲の下限付近では、それ自体では許容可能な校正を確立できません。 Eurachem は、回帰挙動を評価し、応答の分散が濃度とともに変化する場合の重み付けを考慮することを推奨しています。プロットされた線の外観ではなく、実験的証拠を使用してモデルを選択します。 [10]
独自に用意したコントロールを使用して、範囲内のパフォーマンスを評価します。必要な精度とバイアスをサポートできる最低濃度を確立します。信号の検出だけでは不十分です。希釈が必要なサンプルについては、希釈によって有効な結果が維持されることを実証します。サンプルシーケンスを評価する前に合格基準を記録し、除外されたキャリブレーションポイントの理由を保持します。無関係なアッセイから数値限界をインポートすることなく、分析目的に適した基準を適用します。
測定に使用した濃度での溶解、移行、保持期間を評価します。 Goebel-Stengel らは、ペプチドの回収率が接触した表面に依存する可能性があることを実証しました。独立したサンプル前処理はこの寄与を明らかにするのに役立ちますが、同じバイアルから繰り返し機器測定を行うと、以前の前処理の損失を再現できません。適切な新鮮なアリコートと保持されたアリコートを比較し、ろ過またはクリーンアップ後の回収率を調査します。 [11]
LC-MS の場合、応答の変化は、共溶出するサンプル成分によって引き起こされるイオン化の変化を反映している可能性があります。 Matuszewskiらは、マトリックス効果と抽出回収を区別する実験について説明した。ペプチド法に適用すると、濃度、体積、および内因性の寄与が一貫して処理される場合、ニート標準、抽出後に強化されたブランク抽出物、および抽出前に強化されたサンプル間の比較は、これらの影響を分離するのに役立ちます。内部標準で正規化された応答と個々の信号を評価します。 [12]
特定の質問に答える空白を含めます。試薬ブランクは導入されたバックグラウンドを検査します。濃縮サンプル後のブランクはキャリーオーバーを検査します。完全に空のサンプル マトリックスが利用できない場合は、代替設計とその制限を文書化します。スパイク実験では、テスト条件下で添加された材料の回収率を評価します。元々存在していた分析物が完全に回収されたこと、または干渉がなかったことを証明するものではありません。
不確実性の評価は測定モデルに従い、影響力のある寄与を含める必要があります。これらは、キャリブレーター値の割り当て、計量と希釈、調製物の回収、キャリブレーションと再現性から発生する可能性があります。必要に応じて、共有された入力と相関関係を考慮します。 JCGM 測定における不確かさの表現に関するガイドは、そのような情報を組み合わせて結果を報告するためのフレームワークを提供します。繰り返しの測定からの小さな標準偏差は、それらの測定によって表される変動のみを表します。 [13]
サンプルとバッチの識別子、定義されたペプチド種、測定量、単位、メソッドのバージョン、および校正基準を報告します。独立した調製物の数と種類、および希釈または回収補正がどのように適用されたかを記載します。不確実性の拡大が報告された場合は、適用係数と評価によって正当化される解釈を特定します。基礎となるクロマトグラムまたはスペクトル、統合の決定、および制御結果を保存します。
方法が一致しない場合は、まず化学選択性と報告ベースを比較します。加水分解物に基づく推定値、分解されたインタクトペプチドアッセイ、および粉末質量は、異なる量を指す場合があります。不一致を機器の性能のせいにする前に、その違いを解決してください。有用な結果は、定義されたサンプルに関連付けられた量であり、追跡可能な実験記録によって裏付けられます。
研究範囲。この記事は、実験室サンプル中のペプチド物質の分析定量に関するものです。人間や動物への使用に関する指示は提供されておらず、生物学的有効性、臨床適合性、または規制当局の承認についても主張されていません。各測定手順では、対象となるサンプルと実験室の目的に応じた評価が必要です。
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