Bởi Cocer Peptide          26 ngày trước.

Tóm tắt

Kết quả định lượng peptide cần có loại hóa chất xác định, cơ sở hiệu chuẩn thích hợp và bằng chứng cho thấy việc xử lý mẫu sẽ bảo toàn được số lượng được đo. Khối lượng bột, phần trăm diện tích sắc ký và nồng độ peptide mục tiêu mô tả các đặc tính khác nhau. Việc coi chúng là có thể hoán đổi cho nhau có thể gây ra lỗi trước khi thực hiện phép đo đầu tiên. Bài viết này xem xét phân tích axit amin, độ hấp thụ tia cực tím, sắc ký lỏng hiệu chuẩn, phép đo khối phổ pha loãng đồng vị và cộng hưởng từ hạt nhân định lượng như các phương pháp định lượng peptide. Nó giải thích thông tin mà mỗi phương pháp cung cấp, các giả định cần thiết để chuyển đổi tín hiệu thành số lượng và các biện pháp kiểm soát cần thiết để có được kết quả có thể giải thích được. Cuộc thảo luận liên quan đến vật liệu phòng thí nghiệm và các giải pháp phân tích. Nó cung cấp một khuôn khổ để lựa chọn và đánh giá một quy trình đo mà không quy định các điều kiện vận hành chung hoặc giới hạn chấp nhận.

Xác định đại lượng cần đo

Chỉ định đại lượng đo, nghĩa là đại lượng dự định đo, trước khi chọn dụng cụ. Các ví dụ bao gồm lượng peptit nguyên vẹn trong một phần mẫu, nồng độ khối lượng của nó trong dung dịch đã chuẩn bị, hoặc phần khối lượng của nó trong mẫu rắn khi nhận được. Xác định trình tự, nhóm đầu cuối và các sửa đổi có liên quan. Cho biết khối lượng được báo cáo bao gồm các phản ứng hay chỉ mô tả phần peptit. Kết quả cũng cần có ranh giới mẫu xác định: phần hòa tan, toàn bộ chế phẩm hoặc vật liệu được thu hồi sau một thao tác xác định.

Một chất rắn được cân có thể chứa nước, phản ion, dung môi còn sót lại và các thành phần khác. Một pic mục tiêu lớn trong sắc ký tia cực tím không đo được tất cả các thành phần này. Wang và các đồng nghiệp đã chứng minh một phương pháp cân bằng khối lượng kết hợp các phép đo của một số loại tạp chất để mô tả đặc tính của vật liệu peptide tổng hợp. Điều này minh họa tại sao phần trăm diện tích sắc ký không thể tự động thay thế cho phần khối lượng peptit khi chuẩn bị chất chuẩn định lượng. [1]

Thiết lập cơ sở hiệu chuẩn

Người hiệu chuẩn cần một đại lượng được ấn định phù hợp với phép đo, cùng với độ không đảm bảo của nó và các điều kiện áp dụng phép ấn định đó. Kiểm tra giấy chứng nhận để biết chính xác lô hàng, dạng hóa học, cơ sở giá trị và hướng dẫn xử lý. Chỉ nhãn ghi rõ độ tinh khiết sắc ký không cung cấp nồng độ mục tiêu. Bunk và Lowenthal mô tả việc sử dụng phân tích axit amin pha loãng đồng vị tại NIST để hỗ trợ việc xác định nồng độ cho các vật liệu tham chiếu peptide và protein. Việc phân công như vậy đòi hỏi phải có quy trình đo lường được ghi lại bằng văn bản chứ không phải trọng lượng bột danh nghĩa. [2]

Đối với dung dịch được chuẩn bị định lượng từ vật liệu có phần khối lượng mục tiêu đã được thiết lập, nồng độ khối lượng là:

ρ = m × w / V

Ở đây, m là khối lượng vật liệu được cân, w là phần khối lượng peptide mục tiêu của nó trên cùng một cơ sở và V là thể tích dung dịch cuối cùng. Nếu m tính bằng miligam, w tính bằng miligam trên miligam và V tính bằng mililit thì ρ tính bằng miligam trên mililit. Việc tính toán giả định sự hòa tan và chuyển giao hoàn toàn. Nó không xác minh những hoạt động đó. Việc chuyển đổi sang nồng độ lượng đòi hỏi khối lượng mol của các loại hóa chất được xác định rõ ràng.

Chuẩn bị giải pháp kiểm tra độc lập khi khả thi. Các tiêu chuẩn hiệu chuẩn và kiểm tra bắt nguồn từ một kho hàng được chỉ định không chính xác có thể thống nhất với nhau mặc dù có cùng một lỗi. Bảo quản hồ sơ chuẩn bị gốc và pha loãng để có thể xây dựng lại nguồn của mỗi nồng độ đã chỉ định.

Chọn phương pháp có độ chọn lọc hóa học phù hợp

Chọn phương pháp tùy theo thành phần mẫu, nồng độ dự kiến ​​và độ không đảm bảo đo cần thiết cho thí nghiệm. Vật liệu tham chiếu tương đối tinh khiết và hỗn hợp chứa một số peptit liên quan sẽ gây ra các vấn đề đo lường khác nhau. Bảng 1 so sánh các lựa chọn chính được thảo luận dưới đây. Câu hỏi giới hạn là liệu phản hồi đo được có thể quy cho mục tiêu đã xác định với đủ độ tin cậy hay không.

Bảng 1 Các phương án đo lường và những hạn chế chính của chúng

Liên hệ các phép đo axit amin với lượng peptide

Phân tích axit amin trước tiên chuyển đổi một peptit thành các axit amin thành phần có thể đo lường được. Đối với một dư lượng xuất hiện ν _i lần trong trình tự, lượng n _{i quan sát được} sẽ tương ứng với lượng peptit n _i / ν _i nếu quá trình giải phóng hoàn toàn và không có nguồn nào khác đóng góp axit amin đó. So sánh các ước tính từ một số dư lượng phù hợp nếu trình tự cho phép. Sự bất đồng có thể tiết lộ một vấn đề mà cách tính trung bình có thể che giấu.

Quá trình thủy phân phải giải phóng các dư lượng đã chọn mà không làm mất đi hoặc chuyển đổi lượng axit amin đo được ở mức không thể chấp nhận được. Bunk và Lowenthal nhấn mạnh rằng những điều kiện này yêu cầu phải được xác nhận đối với từng chất phân tích. Muñoz và các đồng nghiệp đã đánh giá một số axit amin khi định lượng chất hiệu chuẩn protein bằng cách pha loãng đồng vị, đưa ra một ví dụ thực nghiệm về việc sử dụng thỏa thuận giữa các ước tính dựa trên dư lượng để đánh giá quá trình thủy phân. Các điều kiện được thiết lập cho một vật liệu không nên được coi là đầy đủ cho một peptit khác. [2,3]

Các axit amin tự do và các peptide khác có thể góp phần vào quá trình thủy phân. Do đó, chỉ riêng việc phân tích axit amin có thể xác định hàm lượng tổng số liên quan đến chế phẩm mà không cần định lượng một cách có chọn lọc trình tự nguyên vẹn dự kiến. Bao gồm các mẫu trắng thủy phân phù hợp và điều tra những đóng góp này trước khi ấn định giá trị mục tiêu. Sử dụng nhận dạng hóa học và dạng axit amin tự do khi tính toán lượng chất hiệu chuẩn. Ví dụ: PubChem xác định glycine là CID 750; bản ghi cơ sở dữ liệu hỗ trợ việc kiểm tra danh tính nhưng không chứng nhận hàm lượng của vật liệu tham chiếu axit amin. [4]

Giải thích các phép đo tia cực tím thông qua trình tự

Đối với dung dịch đồng nhất trong phạm vi thiết bị thích hợp, mối quan hệ Beer–Lambert A = εlc kết nối độ hấp thụ A được hiệu chỉnh trống với độ hấp thụ mol ε, độ dài đường quang l và nồng độ lượng c. Độ hấp thụ phải tương ứng với peptide, bước sóng và điều kiện đo. Độ hấp thụ gần 280 nm phụ thuộc nhiều vào dư lượng thơm và không thể dùng làm phép đo nồng độ chung cho mọi peptide. Anthis và Clore đã phát triển một phương pháp tiếp cận dựa trên trình tự ở bước sóng 205 nm, cho thấy giá trị của việc tính toán thành phần thay vì áp dụng một hệ số chuyển đổi duy nhất. [5]

Ở bước sóng ngắn hơn, sự hấp thụ dung môi và chất đệm có thể bị hạn chế. Sử dụng mẫu trắng phù hợp với thành phần, kiểm tra phạm vi quang học có thể sử dụng và so sánh các độ pha loãng phù hợp. Độ đục hoặc tạp chất hấp thụ có thể tạo ra sự thay đổi nồng độ rõ ràng không liên quan đến mục tiêu. Do đó, kết quả độ hấp thụ trực tiếp phải mang các giả định về thành phần mẫu mà nó phụ thuộc vào.

Việc tách sắc ký có thể cải thiện độ chọn lọc trước khi đo UV, nhưng xét nghiệm LC định lượng vẫn yêu cầu mối quan hệ phản ứng thích hợp. Kuipers và Gruppen đã đo sự đóng góp khác nhau của axit amin và liên kết peptit vào độ hấp thụ ở bước sóng 214 nm. Phát hiện của họ giải thích tại sao diện tích pic bằng nhau của các peptide khác nhau không nhất thiết phải biểu thị lượng bằng nhau. Để định lượng mục tiêu, hãy so sánh phản hồi mục tiêu đã giải quyết với các tiêu chuẩn được chỉ định phù hợp và xác minh việc hiệu chuẩn trong các điều kiện phân tích thực tế. [6]

Đánh giá chất nội chuẩn trong dung dịch pha loãng đồng vị LC–MS

Trong pha loãng đồng vị LC–MS, phản ứng của mục tiêu được so sánh với phản ứng của đối tượng được dán nhãn đồng vị được thêm vào thông qua mô hình hiệu chuẩn xác định. Xác nhận danh tính, lượng được chỉ định và thành phần đồng vị của chuẩn đó. Kiểm tra sự tương ứng về sắc ký, các kênh ion liên quan và khả năng đóng góp của vật liệu không ghi nhãn vào kênh mục tiêu. Stoyanov và các đồng nghiệp đã minh họa sự không đồng nhất không được tính toán trong các tiêu chuẩn nội bộ peptide có thể làm sai lệch nồng độ mục tiêu thu được. Chỉ riêng việc ghi nhãn không thiết lập được một tham chiếu định lượng đáng tin cậy. [7]

Thêm chất chuẩn nội vào một giai đoạn thích hợp với lượng thất thoát mà nó dự định theo dõi và chứng minh rằng nó hoạt động đủ giống với chất phân tích. Tiêu chuẩn được đưa ra sau quá trình chiết không thể khắc phục được những tổn thất xảy ra trong quá trình chiết đó. Ngay cả việc bổ sung sớm cũng cần có sự pha trộn đầy đủ và hành vi có thể so sánh được. Giữ lại cả phản hồi tuyệt đối và tỷ lệ của chúng: tỷ lệ ổn định có thể che giấu những thay đổi lớn về độ nhạy hoặc cách xử lý mẫu đáng được điều tra.

Chọn các chuyển tiếp hoặc tín hiệu ion được chiết phù hợp rõ ràng với mục tiêu trong ma trận mẫu. Bản thân giá trị khối lượng trên điện tích phù hợp không phải là bằng chứng cho thấy thành phần gây nhiễu không có. Kết quả peptide nguyên vẹn cũng không được chuyển đổi thành nồng độ protein gốc mà không thiết lập riêng mối quan hệ tiêu hóa và phục hồi.

Sử dụng NMR định lượng với các tín hiệu và tham chiếu được chỉ định

Proton định lượng NMR liên hệ tín hiệu tích hợp của cộng hưởng được chỉ định với số lượng hạt nhân đóng góp và tham chiếu định lượng. Đối với thử nghiệm tham chiếu nội bộ, mối quan hệ số lượng có thể được biểu diễn dưới dạng:

n _x = n _r × ( I _x / N _x ) / ( I _r / N _r )

Các chỉ số x và r biểu thị chất phân tích và chất tham chiếu. I là tín hiệu tích hợp và N là số proton được biểu thị bởi tín hiệu đó; n _r là lượng tham chiếu được chỉ định. Biểu thức giả định đáp ứng tín hiệu có thể so sánh về mặt định lượng và gán đỉnh chính xác. Việc chuyển đổi kết quả sang khối lượng peptide cần có khối lượng mol trên cơ sở báo cáo đã nêu.

Li và các đồng nghiệp đã so sánh qNMR, phân tích axit amin và HPLC hiệu chuẩn trong một nghiên cứu hợp tác về vật liệu tham chiếu peptide. Công trình đã chứng minh việc sử dụng qNMR trong thực tế và cũng cho thấy rằng việc so sánh phương pháp phụ thuộc vào cách xử lý các tiêu chuẩn và độ không đảm bảo. Phát hiện của nó không thiết lập một bảng xếp hạng chung cho tất cả các mẫu peptide. [8]

Phân giải tín hiệu phân tích và tham chiếu đã chọn khỏi tạp chất, dung môi và lẫn nhau. Thiết lập các điều kiện xung và phục hồi phù hợp, ranh giới tín hiệu trên nhiễu và tích hợp. Hướng dẫn BIPM giải thích lý do tại sao phải đánh giá độ giãn đối với các tín hiệu trong hỗn hợp thực tế. Tham chiếu độ dịch chuyển hóa học không tự động là một tiêu chuẩn định lượng. Các tạp chất có liên quan chặt chẽ có chung cộng hưởng tích hợp có thể đóng góp vào lượng đo được ngay cả khi tích phân có độ lặp lại cao. [9]

8 Chứng minh phạm vi hiệu chuẩn

Chuẩn bị các mức hiệu chuẩn bao gồm phản hồi mẫu dự kiến ​​và đánh giá mô hình phản hồi đã chọn. Kiểm tra dư lượng và nồng độ được tính toán lại từ đường cong. Hệ số xác định cao, R², tự nó không thể thiết lập hiệu chuẩn chấp nhận được, đặc biệt là ở gần đầu dưới của dải. Eurachem khuyến nghị đánh giá hành vi hồi quy và xem xét trọng số khi phương sai phản ứng thay đổi theo nồng độ. Chọn mô hình sử dụng bằng chứng thực nghiệm thay vì biểu hiện bằng đường vẽ. [10]

Sử dụng các biện pháp kiểm soát được chuẩn bị độc lập để đánh giá hiệu suất trong phạm vi. Thiết lập nồng độ thấp nhất có thể hỗ trợ độ chính xác và độ lệch yêu cầu; chỉ phát hiện tín hiệu là không đủ. Đối với các mẫu cần pha loãng, chứng minh rằng việc pha loãng bảo toàn kết quả hợp lệ. Ghi lại tiêu chí chấp nhận trước khi đánh giá trình tự mẫu và giữ lại lý do loại trừ bất kỳ điểm hiệu chuẩn nào. Áp dụng các tiêu chí phù hợp với mục tiêu phân tích mà không cần nhập các giới hạn bằng số từ xét nghiệm không liên quan.

Tách biệt tổn thất xử lý khỏi hiệu ứng ma trận

Đánh giá thời gian hòa tan, chuyển giao và lưu giữ ở nồng độ được sử dụng để đo. Goebel-Stengel và các đồng nghiệp đã chứng minh rằng khả năng phục hồi peptit có thể phụ thuộc vào bề mặt tiếp xúc. Việc chuẩn bị mẫu độc lập giúp phát hiện sự đóng góp này, trong khi các phép đo lặp lại bằng dụng cụ từ cùng một lọ không thể tạo ra sự mất mát khi chuẩn bị trước đó. So sánh các phần mẫu tươi và phần giữ lại thích hợp và điều tra độ thu hồi sau bất kỳ quá trình lọc hoặc làm sạch nào. [11]

Đối với LC–MS, sự thay đổi trong phản ứng có thể phản ánh sự thay đổi về độ ion hóa gây ra bởi các thành phần mẫu cùng rửa giải. Matuszewski và các đồng nghiệp đã mô tả các thí nghiệm phân biệt hiệu ứng nền với quá trình thu hồi chiết xuất. Áp dụng cho phương pháp peptit, việc so sánh giữa các tiêu chuẩn nguyên chất, dịch chiết trắng được tăng cường sau khi chiết và các mẫu được tăng cường trước khi chiết có thể giúp tách biệt những ảnh hưởng này, miễn là nồng độ, thể tích và các thành phần nội sinh được xử lý một cách nhất quán. Đánh giá phản ứng chuẩn hóa theo tiêu chuẩn nội bộ cũng như các tín hiệu riêng lẻ. [12]

Bao gồm các khoảng trống trả lời các câu hỏi cụ thể. Một mẫu trắng thuốc thử kiểm tra nền được đưa vào; một mẫu trắng sau khi kiểm tra mẫu cô đặc. Khi không có sẵn nền mẫu thực sự trống, hãy ghi lại thiết kế thay thế và những hạn chế của nó. Thí nghiệm tăng đột biến đánh giá khả năng thu hồi vật liệu được thêm vào trong các điều kiện đã được thử nghiệm; nó không chứng minh rằng chất phân tích có mặt ban đầu đã được phục hồi hoàn toàn hoặc không bị nhiễu.

Báo cáo kết quả với độ không đảm bảo và phạm vi của nó

Việc đánh giá độ không đảm bảo phải tuân theo mô hình đo lường và bao gồm những đóng góp có ảnh hưởng. Những vấn đề này có thể phát sinh từ việc ấn định giá trị của bộ hiệu chuẩn, cân và pha loãng, thu hồi chuẩn bị, hiệu chuẩn và độ lặp lại. Tính đến các đầu vào được chia sẻ và các mối tương quan khi có liên quan. Hướng dẫn JCGM về thể hiện độ không đảm bảo đo cung cấp khuôn khổ để kết hợp các thông tin đó và báo cáo kết quả. Độ lệch chuẩn nhỏ so với các phép đo lặp lại chỉ mô tả sự biến thiên được biểu thị bằng các phép đo đó. [13]

Báo cáo số nhận dạng mẫu và lô, loại peptit đã xác định, số lượng đo được, đơn vị, phiên bản phương pháp và cơ sở hiệu chuẩn. Nêu rõ số lượng và loại chế phẩm độc lập và cách áp dụng độ pha loãng hoặc hiệu chỉnh độ thu hồi. Nếu độ không đảm bảo mở rộng được báo cáo, hãy xác định hệ số bao phủ và cách giải thích được chứng minh bằng đánh giá. Bảo toàn sắc ký đồ hoặc quang phổ cơ bản, các quyết định tích phân và kết quả kiểm chứng.

Khi các phương pháp không thống nhất, trước tiên hãy so sánh độ chọn lọc hóa học và cơ sở báo cáo của chúng. Ước tính dựa trên chất thủy phân, xét nghiệm peptide nguyên vẹn được phân giải và khối lượng bột có thể đề cập đến các đại lượng khác nhau. Giải quyết sự khác biệt đó trước khi quy sự bất đồng vào hiệu suất của nhạc cụ. Kết quả hữu ích là một đại lượng gắn liền với một mẫu xác định và được hỗ trợ bởi hồ sơ thử nghiệm có thể theo dõi được.

Phạm vi nghiên cứu. Bài viết này liên quan đến việc định lượng phân tích vật liệu peptide trong các mẫu phòng thí nghiệm. Nó không cung cấp hướng dẫn sử dụng cho người hoặc thú y và không đưa ra tuyên bố nào về hiệu quả sinh học, tính phù hợp lâm sàng hoặc phê duyệt theo quy định. Mỗi quy trình đo lường đều yêu cầu đánh giá mẫu dự định và mục tiêu của phòng thí nghiệm.

Tài liệu tham khảo

[1] Wang X, Zhang F, Li H, và cộng sự. Xác định độ tinh khiết của glucagon tổng hợp bằng phương pháp cân bằng khối lượng. Báo cáo khoa học. 2020;10:4423. doi: 10.1038/s41598-020-61109-9

[2] Bunk DM, Lowenthal MS. Phương pháp sắc ký lỏng pha loãng đồng vị-khối phổ song song để phân tích định lượng axit amin. Trong: Phân tích axit amin: Phương pháp và giao thức. tái bản lần thứ 2. Các phương pháp sinh học phân tử. 2019;2030. Chương 12. doi: 10.1007/978-1-4939-9639-1_12

[3] Muñoz A, Kral R, Schimmel H. Định lượng chất hiệu chuẩn protein bằng phân tích axit amin bằng phương pháp quang phổ khối pha loãng đồng vị. Hóa sinh phân tích. 2011;408(1):124–131. doi: 10.1016/j.ab.2010.08.037

[4] Trung tâm Thông tin Công nghệ sinh học Quốc gia. Tóm tắt hợp chất PubChem cho CID 750, Glycine. Truy cập ngày 2 tháng 11 năm 2026. Tài liệu nguồn

[5] Anthis NJ, Clore GM. Xác định trình tự cụ thể nồng độ protein và peptide bằng độ hấp thụ ở bước sóng 205 nm. Khoa học về Protein. 2013;22(6):851–858. doi: 10.1002/pro.2253

[6] Kuipers BJH, Gruppen H. Dự đoán hệ số tuyệt chủng mol của protein và peptide bằng cách sử dụng sự hấp thụ tia cực tím của các axit amin cấu thành ở bước sóng 214nm để cho phép phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo định lượng. Tạp chí Hóa học Nông nghiệp và Thực phẩm. 2007;55(14):5445–5451. doi: 10.1021/jf070337l

[7] Stoyanov AV, Rogatsky E, Stein D, và cộng sự. Xét nghiệm pha loãng đồng vị trong định lượng peptide: Thách thức về tính không đồng nhất vi mô của chất chuẩn nội. Ứng dụng lâm sàng của Proteomics. 2013;7(11–12):825–828. doi: 10.1002/prca.201200130

[8] Li C, Bhavaraju S, Melanson JE, và cộng sự. Khảo sát các phương pháp định lượng peptide và so sánh độ tái lập của chúng: Một nghiên cứu điển hình sử dụng oxytocin. Tạp chí Phân tích Dược phẩm và Y sinh. 2019;166:105–112. doi: 10.1016/j.jpba.2018.12.028

[9] Westwood S, Stoppacher N, Martos G, và cộng sự. Dữ liệu tham chiếu chuẩn nội cho qNMR: Axit benzoic 3,5-Bis(trifluoromethyl). Báo cáo BIPM-2019/02, ISRD-05. Phiên bản 1.0; Ngày 13 tháng 3 năm 2019. Phần 3. Tài liệu nguồn

[10] Cantwell H, chủ biên. Sự phù hợp cho mục đích của các phương pháp phân tích: Hướng dẫn trong phòng thí nghiệm về xác nhận phương pháp và các chủ đề liên quan. tái bản lần thứ 3. Eurachem; 2025. Mục 5.2–5.4. Tài liệu nguồn

[11] Goebel-Stengel M, Stengel A, Taché Y, Reeve JR Jr. Tầm quan trọng của việc sử dụng đồ nhựa và đồ thủy tinh tối ưu trong các nghiên cứu liên quan đến peptide. Hóa sinh phân tích. 2011;414(1):38–46. doi: 10.1016/j.ab.2011.02.009

[12] Matuszewski BK, Constanzer ML, Chavez-Eng CM. Các chiến lược đánh giá hiệu quả nền mẫu trong các phương pháp phân tích sinh học định lượng dựa trên HPLC-MS/MS. Hóa phân tích. 2003;75(13):3019–3030. doi: 10.1021/ac020361s

[13] Ủy ban hỗn hợp về hướng dẫn đo lường. Đánh giá dữ liệu đo lường: Hướng dẫn trình bày độ không đảm bảo đo. JCGM 100:2008. Phiên bản đã sửa 2010. Phần 4–7. Tài liệu nguồn

TẤT CẢ CÁC BÀI VIẾT VÀ THÔNG TIN SẢN PHẨM ĐƯỢC CUNG CẤP TRÊN TRANG WEB NÀY CHỈ DÀNH CHO PHỔ BIẾN THÔNG TIN VÀ MỤC ĐÍCH GIÁO DỤC.

Các sản phẩm được cung cấp trên trang web này chỉ dành riêng cho nghiên cứu in vitro. Nghiên cứu trong ống nghiệm (tiếng Latin: *in glass*, nghĩa là trong đồ thủy tinh) được tiến hành bên ngoài cơ thể con người. Những sản phẩm này không phải là dược phẩm, chưa được Cơ quan Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) phê duyệt và không được sử dụng để ngăn ngừa, điều trị hoặc chữa khỏi bất kỳ tình trạng y tế, bệnh tật hoặc bệnh tật nào. Pháp luật nghiêm cấm việc đưa các sản phẩm này vào cơ thể người hoặc động vật dưới mọi hình thức.