Írta: Cocer Peptides 
26 nappal ezelőtt.
A kvantitatív peptideredményhez meghatározott kémiai fajra, megfelelő kalibrációs alapra és annak bizonyítékára van szükség, hogy a mintakezelés megőrzi a mért mennyiséget. A por tömege, a kromatográfiás terület százaléka és a célpeptid koncentrációja különböző tulajdonságokat ír le. Ha ezeket felcserélhetőként kezeli, az az első mérés előtt hibát okozhat. Ez a cikk az aminosavelemzést, az ultraibolya abszorbanciát, a kalibrált folyadékkromatográfiát, az izotóphígításos tömegspektrometriát és a kvantitatív mágneses magrezonanciát vizsgálja a peptidek mennyiségi meghatározásának megközelítéseként. Elmagyarázza az egyes módszerek által szolgáltatott információkat, a jelek mennyiségre való átalakításához szükséges feltételezéseket és az értelmezhető eredményhez szükséges vezérlőket. A vita a laboratóriumi anyagokról és az analitikai megoldásokról szól. Keretet ad a mérési eljárás kiválasztásához és értékeléséhez, anélkül, hogy univerzális működési feltételeket vagy elfogadási határokat írna elő.
A műszer kiválasztása előtt adja meg a mérendő mennyiséget, vagyis a mérni kívánt mennyiséget. A példák közé tartozik az érintetlen peptid mennyisége egy alikvotban, tömegkoncentrációja egy elkészített oldatban vagy tömeghányada egy szilárd mintában, ahogy azt megkaptuk. Azonosítsa a sorrendet, a terminálcsoportokat és a vonatkozó módosításokat. Adja meg, hogy a közölt tömeg tartalmaz-e ellenionokat, vagy önmagában írja le a peptidrészt. Az eredményhez egy meghatározott mintahatár is kell: az oldott rész, a teljes készítmény vagy egy meghatározott művelet után visszanyert anyag.
A kimért szilárd anyag tartalmazhat vizet, ellenionokat, maradék oldószereket és egyéb komponenseket. Az ultraibolya kromatogramon látható nagy célcsúcs nem méri az összes összetevőt. Wang és munkatársai olyan tömegmérleg-megközelítést mutattak be, amely több szennyeződési osztály mérését kombinálva jellemezte a szintetikus peptidanyagot. Ez azt szemlélteti, hogy a kromatográfiás terület százaléka miért nem helyettesíthető automatikusan a peptid tömegfrakciójával kvantitatív standard előállítása során. [1]
A kalibrátornak szüksége van egy, a mérésnek megfelelő hozzárendelt mennyiségre, annak bizonytalanságával és a hozzárendelés alkalmazási feltételeivel együtt. Ellenőrizze a tanúsítványt a pontos tételre, kémiai formára, értékalapra és kezelési utasításokra vonatkozóan. A kromatográfiás tisztaságot jelző címke önmagában nem biztosít célkoncentrációt. Bunk és Lowenthal leírja az izotóp-hígítású aminosav-analízis használatát a NIST-nél a peptid- és fehérje-referenciaanyagok koncentráció-hozzárendelésének támogatására. Az ilyen hozzárendelés dokumentált mérési eljárást igényel, nem pedig névleges porsúlyt. [2]
Egy meghatározott céltömeghányaddal rendelkező anyagból mennyiségileg előállított oldat esetén a tömegkoncentráció:
ρ = m × w / V
Itt m a lemért anyag tömege, w a célpeptid tömeghányada ugyanezen alapon, és V a végső oldattérfogat. Ha m milligrammban, w milligramm per milligrammban és V milliliterben értendő, akkor ρ milligramm per milliliter. A számítás teljes feloldódást és átvitelt feltételez. Nem ellenőrzi ezeket a műveleteket. A mennyiségi koncentrációra való átszámításhoz az explicit módon meghatározott kémiai fajok moláris tömegére van szükség.
Ha lehetséges, készítsen független ellenőrző megoldást. Az egy hibásan hozzárendelt készletből származó kalibrációs szabványok és ellenőrzések megegyezhetnek egymással, miközben ugyanazt a hibát hordozzák. Őrizze meg az állomány-előkészítési és hígítási feljegyzéseket, hogy minden hozzárendelt koncentráció forrása rekonstruálható legyen.
Válassza ki a módszert a kísérlethez szükséges mintaösszetétel, várható koncentráció és bizonytalanság alapján. Egy viszonylag tiszta referenciaanyag és egy több rokon peptidet tartalmazó keverék különböző mérési problémákat vet fel. Az 1. táblázat az alábbiakban tárgyalt főbb lehetőségeket hasonlítja össze. A korlátozó kérdés az, hogy a mért válasz kellő biztonsággal tulajdonítható-e a meghatározott célnak.
1. táblázat Mérési lehetőségek és főbb korlátaik
Módszer |
A számszerűsítés alapja |
A vizsgálat korlátozása |
Aminosav elemzés |
A felszabadult aminosavak mennyisége a szekvencia összetételével kapcsolatban. |
A hidrolízis teljessége és más peptidek vagy szabad aminosavak hozzájárulása. |
Közvetlen UV-elnyelés |
A koncentrációhoz kapcsolódó abszorpció megfelelő abszorpciós képesség révén. |
Szekvenciafüggőség, szennyeződések elnyelése és optikai háttér. |
Kalibrált LC UV-detektálással |
Cél csúcsválasz a hozzárendelt peptidstandardokhoz képest. |
Megoldatlan összetevők és különbségek a válaszban vagy a minta visszanyerésében. |
Izotóphígítás LC–MS |
Analit válasz egy jellemzett izotóppal jelölt belső standardhoz viszonyítva. |
Interferenciák, mátrixhatások és a belső standard hozzárendelt mennyisége. |
Kvantitatív NMR |
Az atommagok számához kapcsolódó jelintegrálok és egy mennyiségi referencia. |
Jelátfedés, relaxáció és referencia alkalmasság. |
Az aminosavelemzés először a peptidet mérhető aminosavakká alakítja át. előforduló aminosav esetében a megfigyelt ν i -szer A szekvenciában n i mennyiség egy peptid mennyiségnek felelne meg, n i / ν i ha a felszabadulás teljes lenne, és más forrás nem járult hozzá ehhez az aminosavhoz. Hasonlítsa össze több megfelelő maradék becslését, ahol a szekvencia lehetővé teszi. Az egyet nem értés olyan problémát tárhat fel, amelyet az átlagolás egyébként elfedne.
A hidrolízis során a kiválasztott aminosavakat a mért aminosavak elfogadhatatlan elvesztése vagy átalakulása nélkül kell felszabadítani. Bunk és Lowenthal hangsúlyozzák, hogy ezek a feltételek minden egyes analit esetében validálást igényelnek. Muñoz és munkatársai számos aminosavat értékeltek, amikor a fehérjekalibránsokat izotóphígítással határozták meg, kísérleti példát szolgáltatva a maradék alapú becslések egyezésének alkalmazására a hidrolízis értékelésére. Az egyik anyagra megállapított feltételeket nem szabad megfelelőnek feltételezni egy másik peptid esetében. [2,3]
A szabad aminosavak és más peptidek hozzájárulhatnak a hidrolizátumhoz. Következésképpen az aminosav-analízis önmagában megállapíthatja a teljes összetétellel kapcsolatos tartalmat anélkül, hogy szelektíven számszerűsítené a tervezett érintetlen szekvenciát. A célérték hozzárendelése előtt vegyen be megfelelő hidrolízis-mintákat, és vizsgálja meg ezeket a hozzájárulásokat. A kalibrátor mennyiségének kiszámításakor használja a szabad aminosav kémiai azonosságát és formáját. Például a PubChem a glicint CID 750-ként azonosítja; az adatbázis rekord támogatja az azonosság ellenőrzését, de nem igazolja az aminosav referenciaanyag tartalmát. [4]
A megfelelő műszeres tartományon belüli homogén oldat esetén az A = εlc Beer–Lambert összefüggés a vakpróbával korrigált A abszorbanciát ε moláris abszorpcióval, l optikai úthosszal és c mennyiségkoncentrációval köti össze. Az abszorpciós képességnek meg kell felelnie a peptidnek, a hullámhossznak és a mérési feltételeknek. A 280 nm-hez közeli abszorbancia erősen függ az aromás maradékoktól, és nem szolgálhat általános koncentrációmérésként minden peptid esetében. Anthis és Clore egy szekvenciaalapú megközelítést dolgozott ki 205 nm-en, amely az összetétel figyelembevételének értékét mutatja, nem pedig egyetlen konverziós tényezőt. [5]
Rövidebb hullámhosszon az oldószer és a puffer abszorpciója korlátozóvá válhat. Használjon összetételnek megfelelő vakmintát, ellenőrizze a használható optikai tartományt, és hasonlítsa össze a megfelelő hígításokat. A zavarosság vagy egy abszorbeáló szennyeződés látszólagos koncentrációváltozást idézhet elő, amely független a céltól. A közvetlen abszorbancia eredménynek ezért magában kell foglalnia azokat a mintaösszetételre vonatkozó feltételezéseket, amelyektől függ.
A kromatográfiás elválasztás javíthatja a szelektivitást az UV-mérés előtt, de a kvantitatív LC vizsgálathoz még megfelelő válaszkapcsolatra van szükség. Kuipers és Gruppen 214 nm-en mérte az aminosavak és peptidkötések eltérő hozzájárulását az abszorbanciához. Eredményeik megmagyarázzák, hogy a különböző peptidekből származó egyenlő csúcsterületeknek miért nem kell egyenlő mennyiséget képviselniük. A cél mennyiségi meghatározásához hasonlítsa össze a feloldott célválaszt a megfelelő hozzárendelt standardokkal, és ellenőrizze a kalibrálást a tényleges analitikai körülmények között. [6]
Az LC–MS izotóphígításban a célpont válaszát egy meghatározott kalibrációs modellen keresztül hasonlítják össze egy hozzáadott izotóposan jelölt megfelelőével. Erősítse meg a szabvány azonosságát, hozzárendelt mennyiségét és izotóp-összetételét. Vizsgálja meg a kromatográfiás megfelelést, a releváns ioncsatornákat és a jelöletlen anyag lehetséges hozzájárulását a célcsatornához. Stoyanov és munkatársai azt illusztrálták, hogy a peptid belső standardjainak meg nem nevezett heterogenitása hogyan torzíthatja a kapott célkoncentrációt. A címkézés önmagában nem ad megbízható mennyiségi hivatkozást. [7]
Adja hozzá a belső standardot a követni kívánt veszteségeknek megfelelő szakaszban, és ellenőrizze, hogy megfelelően viselkedik-e, mint az analit. A kitermelés után bevezetett szabvány nem tudja korrigálni a kitermelés során keletkezett veszteségeket. Még a korai hozzáadás is megfelelő keverést és hasonló viselkedést igényel. Tartsa meg az abszolút válaszokat és azok arányát is: a stabil arány nagy változásokat rejthet az érzékenységben vagy a mintakezelésben, amelyek vizsgálatot érdemelnek.
Válassza ki azokat az átmeneteket vagy kivont ionjeleket, amelyek bizonyíthatóan alkalmasak a mintamátrixban szereplő célpontra. A tömeg/töltés arányának megfelelő érték önmagában nem bizonyítja, hogy egy zavaró összetevő hiányzik. Az ép peptideredményt sem szabad átváltani szülőfehérje-koncentrációvá az emésztési és visszanyerési összefüggések külön megállapítása nélkül.
A kvantitatív proton-NMR egy hozzárendelt rezonancia integrált jelét a közreműködő magok számához és egy kvantitatív referenciahoz viszonyítja. Belső referenciakísérlet esetén a mennyiségi összefüggés a következőképpen fejezhető ki:
n x = n r × ( I x / N x ) / ( I r / N r )
Az x és r alsó indexek az analitot és a referenciát jelölik. I az integrált jel, N pedig az adott jel által képviselt protonok száma; n r a hozzárendelt referenciamennyiség. A kifejezés kvantitatívan összehasonlítható jelválaszt és helyes csúcs-hozzárendelést feltételez. Az eredmény peptidtömeggé konvertálásához a megadott jelentési alapon a moláris tömegre van szükség.
Li és munkatársai összehasonlították a qNMR-t, az aminosav-analízist és a kalibrált HPLC-t egy peptid-referenciaanyag közös vizsgálatában. A munka bemutatta a qNMR gyakorlati alkalmazását, és azt is megmutatta, hogy a módszerek összehasonlítása a standardok és a bizonytalanságok kezelésétől függ. Eredményei nem adnak egyetemes rangsort minden peptidmintára. [8]
Oldja fel a kiválasztott analitot és a referenciajeleket a szennyeződésektől, az oldószertől és egymástól. Határozzon meg megfelelő impulzus- és relaxációs feltételeket, jel-zaj és integrációs határokat. A BIPM útmutatás elmagyarázza, miért kell értékelni a relaxációt a tényleges keverékben lévő jelekre. A kémiai eltolódási referencia nem automatikusan mennyiségi szabvány. A szorosan összefüggő szennyeződések, amelyek osztoznak az integrált rezonancián, hozzájárulhatnak a mért mennyiséghez még akkor is, ha az integrál nagymértékben megismételhető. [9]
Készítse elő a kalibrációs szinteket, amelyek lefedik a tervezett mintaválaszt, és értékelje a választott válaszmodellt. Vizsgálja meg a maradékokat és a görbéből visszaszámolt koncentrációkat. Magas meghatározási együttható, R², önmagában nem tud elfogadható kalibrációt létrehozni, különösen a tartomány alsó határa közelében. Az Eurachem azt javasolja, hogy értékelje a regressziós viselkedést, és fontolja meg a súlyozást, ha a válasz varianciája a koncentrációval változik. Válassza ki a modellt kísérleti bizonyítékok alapján, nem pedig rajzolt vonal megjelenését. [10]
Használjon egymástól függetlenül elkészített kontrollokat a tartományon belüli teljesítmény értékeléséhez. Határozza meg azt a legalacsonyabb koncentrációt, amelynél a szükséges pontosság és torzítás támogatható; a jel észlelése önmagában nem elegendő. A hígítást igénylő minták esetében igazolja, hogy a hígítás megőrzi az érvényes eredményt. Jegyezze fel az elfogadási kritériumokat a mintasorozat értékelése előtt, és őrizze meg a kizárt kalibrációs pontok okát. Alkalmazza az analitikai célnak megfelelő kritériumokat anélkül, hogy számszerű határokat importálna egy nem kapcsolódó vizsgálatból.
Értékelje a méréshez használt koncentrációknál az oldódást, az átvitelt és a tárolási időszakokat. Goebel-Stengel és munkatársai kimutatták, hogy a peptid visszanyerése függhet az érintkező felülettől. A független minta-előkészítés segít feltárni ezt a hozzájárulást, míg az ugyanazon fiolából végzett ismételt műszeres mérések nem képesek reprodukálni a korábbi előkészítési veszteséget. Hasonlítsa össze a megfelelő friss és tárolt alikvotokat, és vizsgálja meg a visszanyerést bármilyen szűrés vagy tisztítás után. [11]
Az LC–MS esetében a válasz változása tükrözheti az ionizációban bekövetkezett változást, amelyet a minta együtt eluáló összetevői okoznak. Matuszewski és munkatársai olyan kísérleteket írtak le, amelyek megkülönböztetik a mátrix hatását az extrakciós helyreállítástól. Peptidmódszerre alkalmazva a tiszta standardok, az extrakció után dúsított vakkivonatok és az extrakció előtt dúsított minták összehasonlítása segíthet elválasztani ezeket a hatásokat, feltéve, hogy a koncentrációkat, a térfogatokat és az endogén hozzájárulásokat következetesen kezelik. Értékelje a belső szabvány szerint normalizált választ, valamint az egyes jeleket. [12]
Adjon meg olyan üres helyeket, amelyek konkrét kérdésekre válaszolnak. A reagens vakpróba megvizsgálja a bevitt hátteret; a koncentrált minta utáni vakpróba megvizsgálja az átvitelt. Ha valóban üres mintamátrix nem áll rendelkezésre, dokumentálja az alternatív kialakítást és annak korlátait. Egy tüskekísérlet értékeli a hozzáadott anyag visszanyerését a vizsgált körülmények között; ez nem bizonyítja, hogy az eredetileg jelenlévő analit teljesen visszanyerhető volt, vagy interferenciamentes volt.
A bizonytalanságértékelésnek követnie kell a mérési modellt, és tartalmaznia kell a befolyásoló hozzájárulásokat. Ezek származhatnak a kalibrátor érték hozzárendeléséből, a mérésből és hígításból, a készítmény visszanyeréséből, a kalibrálásból és az ismételhetőségből. Adott esetben vegye figyelembe a megosztott inputokat és összefüggéseket. A JCGM Útmutató a mérési bizonytalanság kifejezéséhez ad keretet az ilyen információk kombinálásához és az eredmények jelentéséhez. Az ismételt mérésektől való kis szórás csak az adott mérések által képviselt eltérést írja le. [13]
Jelentse a minta- és tételazonosítókat, a meghatározott peptidfajtákat, a mért mennyiséget, az egységet, a módszer verzióját és a kalibrációs alapokat. Adja meg a független készítmények számát és típusát, valamint a hígítási vagy visszanyerési korrekció alkalmazásának módját. Ha kiterjesztett bizonytalanságot jelent, azonosítsa a lefedettségi tényezőt és az értékelés által indokolt értelmezést. Őrizze meg a mögöttes kromatogramokat vagy spektrumokat, az integrációs döntéseket és a kontrolleredményeket.
Ha a módszerek nem értenek egyet, először hasonlítsa össze kémiai szelektivitását és jelentési alapjait. A hidrolizátum alapú becslés, a feloldott intakt peptid vizsgálat és a por tömege különböző mennyiségekre vonatkozhat. Oldja fel ezt a különbséget, mielőtt a nézeteltérést a hangszer teljesítményének tulajdonítja. A hasznos eredmény egy meghatározott mintához kötött mennyiség, amelyet nyomon követhető kísérleti rekord támaszt alá.
Kutatási kör. Ez a cikk a laboratóriumi mintákban található peptid anyagok analitikai mennyiségi meghatározásával foglalkozik. Nem tartalmaz emberi vagy állatgyógyászati felhasználásra vonatkozó utasításokat, és nem állítja a biológiai hatékonyságot, a klinikai alkalmasságot vagy a hatósági jóváhagyást. Minden mérési eljárás megköveteli a tervezett minta és a laboratóriumi cél értékelését.
[1] Wang X, Zhang F, Li H és mtsai. Szintetikus glukagon tisztaságának meghatározása tömegmérleg módszerrel. Tudományos Jelentések. 2020;10:4423. doi: 10.1038/s41598-020-61109-9
[2] Bunk DM, Lowenthal MS. Izotóphígítású folyadékkromatográfia-tandem tömegspektrometria kvantitatív aminosav-analízishez. In: Amino Acid Analysis: Methods and Protocols. 2. kiadás Molekuláris biológiai módszerek. 2019;2030. 12. fejezet. doi: 10.1007/978-1-4939-9639-1_12
[3] Muñoz A, Kral R, Schimmel H. Fehérjekalibránsok kvantitatív meghatározása aminosav-analízissel izotóphígításos tömegspektrometriával. Analitikai biokémia. 2011;408(1):124–131. doi: 10.1016/j.ab.2010.08.037
[4] Nemzeti Biotechnológiai Információs Központ. PubChem Compound Summary for CID 750, Glycine. Hozzáférés: 2026. november 2. Forrásdokumentum
[5] Anthis NJ, Clore GM. Fehérje- és peptidkoncentráció szekvencia-specifikus meghatározása 205 nm-en mért abszorbancia alapján. Protein Science. 2013;22(6):851–858. doi: 10.1002/pro.2253
[6] Kuipers BJH, Gruppen H. Fehérjék és peptidek moláris extinkciós együtthatóinak előrejelzése az alkotó aminosavak UV-abszorpciójával 214 nm-en, hogy lehetővé tegye a kvantitatív fordított fázisú, nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás-tömegspektrometriás analízist. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2007;55(14):5445–5451. doi: 10.1021/jf070337l
[7] Stoyanov AV, Rogatsky E, Stein D, et al. Izotóphígítási vizsgálat a peptid mennyiségi meghatározásában: A belső standard mikroheterogenitásának kihívása. Proteomics Clinical Applications. 2013;7(11–12):825–828. doi: 10.1002/prca.201200130
[8] Li C, Bhavaraju S, Melanson JE et al. Peptid kvantifikációs módszerek felmérése és reprodukálhatóságuk összehasonlítása: Esettanulmány oxitocin felhasználásával. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2019;166:105–112. doi: 10.1016/j.jpba.2018.12.028
[9] Westwood S, Stoppacher N, Martos G et al. Belső standard referenciaadatok a qNMR-hez: 3,5-bisz(trifluor-metil)-benzoesav. BIPM-2019/02, ISRD-05 jelentés. 1.0 verzió; 2019. március 13. 3. szakasz. Forrásdokumentum
[10] Cantwell H, szerk. Az analitikai módszerek alkalmassága: Laboratóriumi útmutató a módszerek validálásához és a kapcsolódó témákhoz. 3. kiadás Eurachem; 2025. 5.2–5.4. Forrásdokumentum
[11] Goebel-Stengel M, Stengel A, Taché Y, Reeve JR Jr. Az optimális műanyag- és üvegedény használatának fontossága peptidekkel végzett vizsgálatokban. Analitikai biokémia. 2011;414(1):38–46. doi: 10.1016/j.ab.2011.02.009
[12] Matuszewski BK, Constanzer ML, Chavez-Eng CM. Stratégiák a mátrix hatás felmérésére kvantitatív bioanalitikai módszerekben HPLC-MS/MS alapján. Analitikai kémia. 2003;75(13):3019–3030. doi: 10.1021/ac020361s
[13] Metrológiai útmutatók vegyes bizottsága. A mérési adatok értékelése: Útmutató a mérési bizonytalanság kifejezéséhez. JCGM 100:2008. Javított változat 2010. 4–7. Forrásdokumentum
AZ EZEN WEBOLDALON NYÚJTOTT MINDEN CIKK ÉS TERMÉKINFORMÁCIÓ KIZÁRÓLAG INFORMÁCIÓTERJESZTÉSI ÉS OKTATÁSI CÉLRA SZOLGÁL.
Az ezen a weboldalon található termékek kizárólag in vitro kutatásra szolgálnak. Az in vitro kutatást (latinul: *üvegben*, jelentése üvegedényben) az emberi testen kívül végzik. Ezek a termékek nem gyógyszerek, az Egyesült Államok Élelmiszer- és Gyógyszerügyi Hatósága (FDA) nem hagyta jóvá, és nem használhatók bármilyen egészségügyi állapot, betegség vagy betegség megelőzésére, kezelésére vagy gyógyítására. A törvény szigorúan tilos ezeknek a termékeknek az emberi vagy állati szervezetbe bármilyen formában történő bejuttatását.
