Por Cocer Peptides 
hace 26 días.
Un resultado cuantitativo de péptido requiere una especie química definida, una base de calibración adecuada y evidencia de que el manejo de la muestra preserva la cantidad que se está midiendo. La masa del polvo, el porcentaje del área cromatográfica y la concentración del péptido objetivo describen diferentes propiedades. Tratarlos como intercambiables puede introducir un error antes de realizar la primera medición. Este artículo examina el análisis de aminoácidos, la absorbancia ultravioleta, la cromatografía líquida calibrada, la espectrometría de masas por dilución de isótopos y la resonancia magnética nuclear cuantitativa como enfoques para la cuantificación de péptidos. Explica la información que proporciona cada método, las suposiciones necesarias para convertir su señal en una cantidad y los controles necesarios para un resultado interpretable. La discusión se refiere a materiales de laboratorio y soluciones analíticas. Proporciona un marco para seleccionar y evaluar un procedimiento de medición, sin prescribir condiciones de funcionamiento universales ni límites de aceptación.
Especifique el mensurando, es decir, la cantidad que se pretende medir, antes de seleccionar un instrumento. Los ejemplos incluyen la cantidad de un péptido intacto en una alícuota, su concentración másica en una solución preparada o su fracción másica en una muestra sólida tal como se recibió. Identificar la secuencia, grupos de terminales y modificaciones relevantes. Indique si la masa informada incluye contraiones o describe solo el resto peptídico. El resultado también necesita un límite de muestra definido: la porción disuelta, la preparación completa o el material recuperado después de una operación específica.
Un sólido pesado puede contener agua, contraiones, disolventes residuales y otros componentes. Un pico objetivo grande en un cromatograma ultravioleta no mide todos estos componentes. Wang y sus colegas demostraron un enfoque de equilibrio de masa que combinaba mediciones de varias clases de impurezas para caracterizar un material peptídico sintético. Esto ilustra por qué un porcentaje de área cromatográfica no puede sustituirse automáticamente por una fracción de masa peptídica al preparar un estándar cuantitativo. [1]
Un calibrador necesita una cantidad asignada apropiada para la medición, junto con su incertidumbre y las condiciones bajo las cuales se aplica esa asignación. Consulte el certificado para conocer el lote exacto, la forma química, la base de valor y las instrucciones de manipulación. Una etiqueta que indique la pureza cromatográfica por sí sola no proporciona una concentración objetivo. Bunk y Lowenthal describen el uso del análisis de aminoácidos por dilución de isótopos en el NIST para respaldar las asignaciones de concentración para materiales de referencia de péptidos y proteínas. Una asignación de este tipo requiere un procedimiento de medición documentado, en lugar de un peso de polvo nominal. [2]
Para una solución preparada cuantitativamente a partir de un material con una fracción de masa objetivo establecida, la concentración de masa es:
ρ = m × w / V
Aquí, m es la masa de material pesado, w es la fracción de masa del péptido objetivo sobre la misma base y V es el volumen de solución final. Si m está en miligramos, w en miligramos por miligramo y V en mililitros, ρ está en miligramos por mililitro. El cálculo supone la disolución y transferencia total. No verifica esas operaciones. La conversión a concentración de cantidad requiere la masa molar de la especie química definida explícitamente.
Prepare una solución de verificación independiente cuando sea posible. Los estándares de calibración y los controles derivados de un stock asignado incorrectamente pueden coincidir entre sí y conllevar el mismo error. Conserve los registros de preparación y dilución del stock para que se pueda reconstruir la fuente de cada concentración asignada.
Seleccione el método según la composición de la muestra, la concentración esperada y la incertidumbre necesaria para el experimento. Un material de referencia relativamente puro y una mezcla que contiene varios péptidos relacionados presentan diferentes problemas de medición. La Tabla 1 compara las principales opciones que se analizan a continuación. La pregunta limitante es si la respuesta medida se puede atribuir al objetivo definido con suficiente confianza.
Tabla 1 Opciones de medición y sus principales limitaciones
Método |
Base de cuantificación |
Limitación para investigar |
Análisis de aminoácidos |
Cantidades de aminoácidos liberados relacionados con la composición de la secuencia. |
Completitud de la hidrólisis y aportes de otros péptidos o aminoácidos libres. |
Absorbancia UV directa |
Absorbancia relacionada con la concentración a través de una absortividad adecuada. |
Dependencia de secuencia, absorción de contaminantes y fondo óptico. |
LC calibrado con detección UV |
Respuesta máxima objetivo en comparación con los estándares peptídicos asignados. |
Componentes no resueltos y diferencias en la respuesta o recuperación de muestras. |
Dilución de isótopos LC-MS |
Respuesta del analito en relación con un estándar interno marcado con isótopos caracterizado. |
Interferencias, efectos matriciales y cantidad asignada del estándar interno. |
RMN cuantitativa |
Integrales de señal relacionadas con números de núcleos y una referencia cuantitativa. |
Superposición de señales, relajación e idoneidad de referencia. |
El análisis de aminoácidos primero convierte un péptido en aminoácidos constituyentes mensurables. Para un residuo que aparece ν i veces en la secuencia, una cantidad observada n i correspondería a una cantidad de péptido n i / ν i si la liberación fuera completa y ninguna otra fuente contribuyera con ese aminoácido. Comparar estimaciones de varios residuos adecuados cuando la secuencia lo permita. El desacuerdo puede revelar un problema que, de otro modo, el promedio ocultaría.
La hidrólisis debe liberar los residuos seleccionados sin una pérdida o conversión inaceptable de los aminoácidos medidos. Bunk y Lowenthal enfatizan que estas condiciones requieren validación para cada analito. Muñoz y sus colegas evaluaron varios aminoácidos al cuantificar calibrantes de proteínas mediante dilución de isótopos, proporcionando un ejemplo experimental del uso de la concordancia entre estimaciones basadas en residuos para evaluar la hidrólisis. Las condiciones establecidas para un material no deben asumirse como adecuadas para un péptido diferente. [2,3]
Los aminoácidos libres y otros péptidos pueden contribuir al hidrolizado. En consecuencia, el análisis de aminoácidos por sí solo puede establecer el contenido total relacionado con la composición sin cuantificar selectivamente la secuencia intacta deseada. Incluya blancos de hidrólisis adecuados e investigue estas contribuciones antes de asignar un valor objetivo. Utilice la identidad química y la forma del aminoácido libre al calcular las cantidades de calibrador. Por ejemplo, PubChem identifica la glicina como CID 750; el registro de la base de datos admite la verificación de identidad pero no certifica el contenido de un material de referencia de aminoácidos. [4]
Para una solución homogénea dentro de un rango instrumental apropiado, la relación Beer-Lambert A = εlc conecta la absorbancia A corregida en blanco con la absortividad molar ε, la longitud del camino óptico l y la concentración de cantidad c. La absortividad debe corresponder al péptido, la longitud de onda y las condiciones de medición. La absorbancia cercana a 280 nm depende en gran medida de los residuos aromáticos y no puede servir como medida de concentración general para cada péptido. Anthis y Clore desarrollaron un enfoque basado en secuencias a 205 nm, mostrando el valor de tener en cuenta la composición en lugar de aplicar un único factor de conversión. [5]
En longitudes de onda más cortas, la absorción de disolventes y tampones puede resultar limitante. Utilice un blanco de composición equivalente, compruebe el rango óptico utilizable y compare las diluciones adecuadas. La turbidez o una impureza absorbente pueden producir un cambio aparente de concentración no relacionado con el objetivo. Por lo tanto, un resultado de absorbancia directa debe incluir las suposiciones sobre la composición de la muestra de las que depende.
La separación cromatográfica puede mejorar la selectividad antes de la medición UV, pero un ensayo de LC cuantitativo aún requiere una relación de respuesta adecuada. Kuipers y Gruppen midieron diferentes contribuciones de aminoácidos y enlaces peptídicos a la absorbancia a 214 nm. Sus hallazgos explican por qué áreas de picos iguales de diferentes péptidos no tienen por qué representar cantidades iguales. Para la cuantificación del objetivo, compare la respuesta del objetivo resuelta con los estándares asignados adecuados y verifique la calibración en las condiciones analíticas reales. [6]
En la LC-MS de dilución de isótopos, la respuesta del objetivo se compara con la de una contraparte marcada isotópicamente agregada a través de un modelo de calibración definido. Confirmar la identidad, cantidad asignada y composición isotópica de ese estándar. Examine la correspondencia cromatográfica, los canales iónicos relevantes y la posible contribución del material sin marcar al canal objetivo. Stoyanov y sus colegas ilustraron cómo la heterogeneidad no contabilizada en los estándares internos de péptidos puede sesgar la concentración objetivo resultante. El etiquetado por sí solo no establece una referencia cuantitativa fiable. [7]
Agregue el estándar interno en una etapa apropiada para las pérdidas que se pretende rastrear y establezca que se comporta suficientemente como el analito. Una norma introducida después de una extracción no puede corregir las pérdidas que ocurrieron durante esa extracción. Incluso una adición temprana requiere una mezcla adecuada y un comportamiento comparable. Conserve tanto las respuestas absolutas como su proporción: una proporción estable puede ocultar grandes cambios en la sensibilidad o el manejo de la muestra que merecen investigación.
Seleccione transiciones o señales de iones extraídos que sean demostrablemente adecuadas para el objetivo en la matriz de muestra. Un valor coincidente entre masa y carga no es, por sí solo, una prueba de que falta un componente que interfiere. Un resultado de péptido intacto tampoco debe convertirse en una concentración de proteína original sin establecer por separado las relaciones de digestión y recuperación.
La RMN cuantitativa de protones relaciona la señal integrada de una resonancia asignada con el número de núcleos contribuyentes y una referencia cuantitativa. Para un experimento de referencia interna, la relación de cantidad se puede expresar como:
norte x = norte r × ( yo x / norte x ) / ( yo r / norte r )
Los subíndices x y r indican analito y referencia. I es la señal integrada y N el número de protones representados por esa señal; n r es la cantidad de referencia asignada. La expresión asume una respuesta de señal cuantitativamente comparable y una asignación de pico correcta. Para convertir el resultado a masa peptídica se requiere la masa molar según la base de informe indicada.
Li y sus colegas compararon qNMR, análisis de aminoácidos y HPLC calibrada en un estudio colaborativo de un material de referencia peptídico. El trabajo demostró el uso práctico de qNMR y también mostró que las comparaciones de métodos dependen de cómo se tratan los estándares y las incertidumbres. Sus hallazgos no establecen una clasificación universal para todas las muestras de péptidos. [8]
Resuelva el analito elegido y las señales de referencia de las impurezas, el disolvente y entre sí. Establecer condiciones adecuadas de pulso y relajación, señal-ruido y límites de integración. La guía BIPM explica por qué se debe evaluar la relajación de las señales en la mezcla real. Una referencia de cambio químico no es automáticamente un estándar cuantitativo. Las impurezas estrechamente relacionadas que comparten la resonancia integrada pueden contribuir a la cantidad medida incluso cuando la integral es altamente repetible. [9]
Prepare niveles de calibración que cubran la respuesta de muestra prevista y evalúe el modelo de respuesta elegido. Examine los residuos y las concentraciones calculadas a partir de la curva. Un coeficiente de determinación alto, R², no puede por sí solo establecer una calibración aceptable, especialmente cerca del extremo inferior del rango. Eurachem recomienda evaluar el comportamiento de regresión y considerar la ponderación cuando la varianza de la respuesta cambia con la concentración. Elija el modelo utilizando evidencia experimental en lugar de la apariencia de una línea trazada. [10]
Utilice controles preparados de forma independiente para evaluar el rendimiento dentro del rango. Establecer la concentración más baja en la que se pueda lograr la precisión y el sesgo requeridos; la detección de una señal por sí sola es insuficiente. Para muestras que requieren dilución, demuestre que la dilución preserva un resultado válido. Registre los criterios de aceptación antes de evaluar la secuencia de muestras y conserve el motivo de cualquier punto de calibración excluido. Aplique criterios adecuados al objetivo analítico, sin importar límites numéricos de un ensayo no relacionado.
Evaluar los períodos de disolución, transferencias y retención en las concentraciones utilizadas para la medición. Goebel-Stengel y sus colegas demostraron que la recuperación de péptidos puede depender de la superficie en contacto. Las preparaciones de muestras independientes ayudan a revelar esta contribución, mientras que las mediciones repetidas del instrumento en el mismo vial no pueden reproducir una pérdida de preparación anterior. Compare las alícuotas frescas y retenidas apropiadas e investigue la recuperación después de cualquier filtración o limpieza. [11]
Para LC-MS, un cambio en la respuesta puede reflejar un cambio en la ionización causado por la coelución de los componentes de la muestra. Matuszewski y sus colegas describieron experimentos que distinguen los efectos de la matriz de la recuperación de la extracción. Aplicadas a un método peptídico, las comparaciones entre estándares puros, extractos en blanco fortificados después de la extracción y muestras fortificadas antes de la extracción pueden ayudar a separar estas influencias, siempre que las concentraciones, los volúmenes y las contribuciones endógenas se manejen de manera consistente. Evalúe la respuesta normalizada del estándar interno, así como las señales individuales. [12]
Incluya espacios en blanco que respondan preguntas específicas. Un blanco de reactivo examina el fondo introducido; un blanco después de que una muestra concentrada examina el arrastre. Cuando no se disponga de una matriz de muestra verdaderamente en blanco, documente el diseño alternativo y sus limitaciones. Un experimento de púas evalúa la recuperación del material añadido en las condiciones probadas; no prueba que un analito originalmente presente se haya recuperado completamente o esté libre de interferencias.
La evaluación de la incertidumbre debe seguir el modelo de medición e incluir las contribuciones influyentes. Estos pueden surgir de la asignación de valores del calibrador, el pesaje y la dilución, la recuperación de la preparación, la calibración y la repetibilidad. Tenga en cuenta los aportes compartidos y las correlaciones cuando sea relevante. La Guía JCGM para la expresión de la incertidumbre en la medición proporciona el marco para combinar dicha información y reportar el resultado. Una pequeña desviación estándar de mediciones repetidas describe solo la variación representada por esas mediciones. [13]
Informe los identificadores de muestra y lote, especies de péptidos definidas, cantidad medida, unidad, versión del método y base de calibración. Indique el número y tipo de preparaciones independientes y cómo se aplicó cualquier corrección de dilución o recuperación. Si se informa incertidumbre ampliada, identifique el factor de cobertura y la interpretación justificada por la evaluación. Preservar los cromatogramas o espectros subyacentes, las decisiones de integración y los resultados de control.
Cuando los métodos no estén de acuerdo, primero compare su selectividad química y sus bases de presentación de informes. Una estimación basada en hidrolizado, un ensayo de péptido intacto resuelto y una masa de polvo pueden referirse a diferentes cantidades. Resuelva esa diferencia antes de atribuir el desacuerdo al desempeño del instrumento. El resultado útil es una cantidad vinculada a una muestra definida y respaldada por un registro experimental rastreable.
Alcance de la investigación. Este artículo trata sobre la cuantificación analítica de materiales peptídicos en muestras de laboratorio. No proporciona instrucciones para uso humano o veterinario y no hace ninguna afirmación sobre eficacia biológica, idoneidad clínica o aprobación regulatoria. Cada procedimiento de medición requiere una evaluación de la muestra prevista y del objetivo de laboratorio.
[1] Wang X, Zhang F, Li H, et al. Determinación de la pureza del glucagón sintético mediante un enfoque de balance de masa. Informes científicos. 2020;10:4423. doi: 10.1038/s41598-020-61109-9
[2] Litera DM, Lowenthal MS. Cromatografía líquida de dilución isotópica-espectrometría de masas en tándem para análisis cuantitativo de aminoácidos. En: Análisis de aminoácidos: métodos y protocolos. 2da ed. Métodos en biología molecular. 2019;2030. Capítulo 12. doi: 10.1007/978-1-4939-9639-1_12
[3] Muñoz A, Kral R, Schimmel H. Cuantificación de calibradores de proteínas mediante análisis de aminoácidos mediante espectrometría de masas por dilución de isótopos. Bioquímica analítica. 2011;408(1):124–131. doi: 10.1016/j.ab.2010.08.037
[4] Centro Nacional de Información Biotecnológica. Resumen de compuestos de PubChem para CID 750, glicina. Consultado el 2 de noviembre de 2026. Documento fuente
[5] Anthis Nueva Jersey, Clore GM. Determinación específica de secuencia de concentraciones de proteínas y péptidos mediante absorbancia a 205 nm. Ciencia de las proteínas. 2013;22(6):851–858. doi: 10.1002/pro.2253
[6] Kuipers BJH, Gruppen H. Predicción de coeficientes de extinción molar de proteínas y péptidos utilizando la absorción UV de los aminoácidos constituyentes a 214 nm para permitir el análisis cuantitativo de cromatografía líquida de alto rendimiento y espectrometría de masas en fase inversa. Revista de Química Agrícola y Alimentaria. 2007;55(14):5445–5451. doi: 10.1021/jf070337l
[7] Stoyanov AV, Rogatsky E, Stein D, et al. Ensayo de dilución de isótopos en la cuantificación de péptidos: el desafío de la microheterogeneidad del estándar interno. Aplicaciones clínicas de la proteómica. 2013;7(11–12):825–828. doi: 10.1002/prca.201200130
[8] Li C, Bhavaraju S, Melanson JE, et al. Estudio de métodos de cuantificación de péptidos y comparación de su reproducibilidad: un estudio de caso utilizando oxitocina. Revista de análisis farmacéutico y biomédico. 2019;166:105–112. doi: 10.1016/j.jpba.2018.12.028
[9] Westwood S, Stoppacher N, Martos G, et al. Datos de referencia del estándar interno para qNMR: ácido 3,5-bis(trifluorometil)benzoico. Informe BIPM-2019/02, ISRD-05. Versión 1.0; 13 de marzo de 2019. Sección 3. Documento fuente
[10] Cantwell H, ed. La idoneidad de los métodos analíticos para el propósito: una guía de laboratorio para la validación de métodos y temas relacionados. 3ª edición. Eurachem; 2025. Secciones 5.2 a 5.4. Documento fuente
[11] Goebel-Stengel M, Stengel A, Taché Y, Reeve JR Jr. La importancia de utilizar materiales de plástico y cristalería óptimos en estudios con péptidos. Bioquímica analítica. 2011;414(1):38–46. doi: 10.1016/j.ab.2011.02.009
[12] Matuszewski BK, Constanzer ML, Chávez-Eng CM. Estrategias para la evaluación del efecto matriz en métodos bioanalíticos cuantitativos basados en HPLC-MS/MS. Química Analítica. 2003;75(13):3019–3030. doi: 10.1021/ac020361s
[13] Comité Conjunto de Guías en Metrología. Evaluación de datos de medición: guía para la expresión de la incertidumbre en la medición. JCGM 100:2008. Versión corregida 2010. Secciones 4 a 7. Documento fuente
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