Oleh Cocer Peptida          26 hari yang lalu.

Abstrak

Hasil peptida kuantitatif memerlukan spesies kimia yang ditentukan, dasar kalibrasi yang tepat, dan bukti bahwa penanganan sampel menjaga kuantitas yang diukur. Massa bubuk, persentase area kromatografi, dan konsentrasi peptida target menggambarkan sifat yang berbeda. Memperlakukannya sebagai sesuatu yang dapat dipertukarkan dapat menimbulkan kesalahan sebelum pengukuran pertama dilakukan. Artikel ini membahas analisis asam amino, serapan ultraviolet, kromatografi cair terkalibrasi, spektrometri massa pengenceran isotop, dan resonansi magnetik nuklir kuantitatif sebagai pendekatan kuantifikasi peptida. Hal ini menjelaskan informasi yang diberikan setiap metode, asumsi yang diperlukan untuk mengubah sinyal menjadi suatu jumlah, dan pengendalian yang diperlukan untuk mendapatkan hasil yang dapat diinterpretasikan. Pembahasannya menyangkut materi laboratorium dan solusi analitis. Ini memberikan kerangka kerja untuk memilih dan menilai prosedur pengukuran, tanpa menetapkan kondisi operasi universal atau batas penerimaan.

Tentukan besaran yang akan diukur

Tentukan besaran ukur, artinya besaran yang ingin diukur, sebelum memilih instrumen. Contohnya termasuk jumlah peptida utuh dalam alikuot, konsentrasi massanya dalam larutan yang disiapkan, atau fraksi massanya dalam sampel padat yang diterima. Identifikasi urutan, grup terminal dan modifikasi yang relevan. Nyatakan apakah massa yang dilaporkan termasuk ion lawan atau hanya menggambarkan bagian peptida saja. Hasilnya juga memerlukan batas sampel yang ditentukan: bagian yang terlarut, seluruh sediaan, atau bahan yang diperoleh kembali setelah operasi tertentu.

Padatan yang ditimbang dapat mengandung air, ion lawan, sisa pelarut, dan komponen lainnya. Puncak target yang besar dalam kromatogram ultraviolet tidak mengukur semua konstituen ini. Wang dan rekannya mendemonstrasikan pendekatan keseimbangan massa yang menggabungkan pengukuran beberapa kelas pengotor untuk mengkarakterisasi bahan peptida sintetik. Hal ini menggambarkan mengapa persentase area kromatografi tidak dapat secara otomatis menggantikan fraksi massa peptida ketika menyiapkan standar kuantitatif. [1]

Tetapkan dasar kalibrasi

Kalibrator memerlukan besaran yang sesuai dengan pengukuran, beserta ketidakpastiannya dan kondisi di mana penetapan tersebut berlaku. Periksa sertifikat untuk lot pastinya, bentuk bahan kimia, dasar nilai dan instruksi penanganan. Label yang menyatakan kemurnian kromatografi saja tidak memberikan konsentrasi target. Bunk dan Lowenthal menjelaskan penggunaan analisis asam amino pengenceran isotop di NIST untuk mendukung penetapan konsentrasi bahan referensi peptida dan protein. Penugasan tersebut memerlukan prosedur pengukuran yang terdokumentasi, bukan berat nominal serbuk. [2]

Untuk larutan yang dibuat secara kuantitatif dari bahan dengan fraksi massa target yang ditetapkan, konsentrasi massanya adalah:

ρ = m × w / V

Di sini, m adalah massa bahan yang ditimbang, w adalah fraksi massa peptida targetnya pada basis yang sama, dan V adalah volume larutan akhir. Jika m dalam miligram, w dalam miligram per miligram, dan V dalam mililiter, ρ dalam miligram per mililiter. Perhitungannya mengasumsikan pembubaran dan pemindahan total. Itu tidak memverifikasi operasi tersebut. Konversi ke jumlah konsentrasi memerlukan massa molar spesies kimia yang ditentukan secara eksplisit.

Siapkan solusi pemeriksaan independen jika memungkinkan. Standar kalibrasi dan cek yang diperoleh dari satu stok yang salah ditetapkan dapat saling cocok satu sama lain namun membawa kesalahan yang sama. Simpan catatan persiapan stok dan pengenceran sehingga sumber dari setiap konsentrasi yang ditetapkan dapat direkonstruksi.

Pilih metode dengan selektivitas kimia yang memadai

Pilih metode berdasarkan komposisi sampel, konsentrasi yang diharapkan, dan ketidakpastian yang diperlukan untuk percobaan. Bahan referensi yang relatif murni dan campuran yang mengandung beberapa peptida terkait menimbulkan masalah pengukuran yang berbeda. Tabel 1 membandingkan opsi-opsi utama yang dibahas di bawah ini. Pertanyaan yang membatasi adalah apakah respons yang diukur dapat dikaitkan dengan target yang ditentukan dengan keyakinan yang cukup.

Tabel 1 Pilihan pengukuran dan batasan utamanya

Kaitkan pengukuran asam amino dengan jumlah peptida

Analisis asam amino pertama-tama mengubah peptida menjadi asam amino penyusun yang dapat diukur. Untuk residu yang terjadi sebanyak ν _i kali dalam rangkaian tersebut, jumlah n _{i yang diamati} akan sesuai dengan jumlah peptida n _i / ν _i jika pelepasannya lengkap dan tidak ada sumber lain yang menyumbangkan asam amino tersebut. Bandingkan perkiraan dari beberapa residu yang sesuai jika urutannya memungkinkan. Ketidaksepakatan dapat mengungkap masalah yang biasanya disembunyikan oleh rata-rata.

Hidrolisis harus melepaskan residu terpilih tanpa kehilangan atau konversi asam amino terukur yang tidak dapat diterima. Bunk dan Lowenthal menekankan bahwa kondisi ini memerlukan validasi untuk setiap analit. Muñoz dan rekannya mengevaluasi beberapa asam amino ketika mengukur kalibrasi protein dengan pengenceran isotop, memberikan contoh eksperimental penggunaan kesepakatan antara perkiraan berbasis residu untuk menilai hidrolisis. Kondisi yang ditetapkan untuk satu bahan tidak boleh dianggap memadai untuk peptida yang berbeda. [2,3]

Asam amino bebas dan peptida lain dapat berkontribusi pada hidrolisat. Akibatnya, analisis asam amino saja dapat menentukan kandungan total yang berkaitan dengan komposisi tanpa secara selektif mengukur urutan utuh yang diinginkan. Sertakan blanko hidrolisis yang sesuai dan selidiki kontribusinya sebelum menetapkan nilai target. Gunakan identitas kimia dan bentuk asam amino bebas saat menghitung jumlah kalibrator. Misalnya, PubChem mengidentifikasi glisin sebagai CID 750; catatan database mendukung pemeriksaan identitas tetapi tidak mengesahkan kandungan bahan referensi asam amino. [4]

Menafsirkan pengukuran ultraviolet melalui urutan

Untuk larutan homogen dalam rentang instrumen yang sesuai, hubungan Beer–Lambert A = εlc menghubungkan serapan kosong A dengan absorptivitas molar ε, panjang jalur optik l dan konsentrasi jumlah c. Absorptivitas harus sesuai dengan peptida, panjang gelombang dan kondisi pengukuran. Absorbansi mendekati 280 nm sangat bergantung pada residu aromatik dan tidak dapat digunakan sebagai pengukuran konsentrasi umum untuk setiap peptida. Anthis dan Clore mengembangkan pendekatan berbasis urutan pada 205 nm, menunjukkan nilai penghitungan komposisi daripada menerapkan faktor konversi tunggal. [5]

Pada panjang gelombang yang lebih pendek, penyerapan pelarut dan buffer dapat menjadi terbatas. Gunakan blanko yang komposisinya cocok, periksa rentang optik yang dapat digunakan, dan bandingkan pengenceran yang sesuai. Kekeruhan atau pengotor yang menyerap dapat menghasilkan perubahan konsentrasi nyata yang tidak berhubungan dengan target. Oleh karena itu, hasil serapan langsung harus mempunyai asumsi tentang komposisi sampel yang menjadi sandarannya.

Pemisahan kromatografi dapat meningkatkan selektivitas sebelum pengukuran UV, namun uji LC kuantitatif masih memerlukan hubungan respons yang sesuai. Kuipers dan Gruppen mengukur perbedaan kontribusi asam amino dan ikatan peptida terhadap penyerapan pada 214 nm. Temuan mereka menjelaskan mengapa area puncak yang sama dari peptida berbeda tidak harus mewakili jumlah yang sama. Untuk kuantifikasi target, bandingkan respons target yang diselesaikan dengan standar yang sesuai dan verifikasi kalibrasi berdasarkan kondisi analitis aktual. [6]

Nilai standar internal dalam pengenceran isotop LC–MS

Dalam pengenceran isotop LC-MS, respons target dibandingkan dengan respons target yang diberi label isotop melalui model kalibrasi yang ditentukan. Konfirmasikan identitas, jumlah yang ditetapkan, dan komposisi isotop standar tersebut. Periksa korespondensi kromatografi, saluran ion yang relevan, dan kemungkinan kontribusi bahan yang tidak berlabel ke saluran target. Stoyanov dan rekannya mengilustrasikan bagaimana heterogenitas yang tidak terhitung dalam standar internal peptida dapat membiaskan konsentrasi target yang dihasilkan. Pelabelan saja tidak dapat menghasilkan acuan kuantitatif yang dapat diandalkan. [7]

Tambahkan standar internal pada tahap yang sesuai dengan kerugian yang ingin dilacak, dan tentukan bahwa standar tersebut berperilaku cukup seperti analit. Standar yang diperkenalkan setelah ekstraksi tidak dapat memperbaiki kerugian yang terjadi selama ekstraksi tersebut. Bahkan penambahan awal memerlukan pencampuran yang memadai dan perilaku yang sebanding. Pertahankan respons absolut dan rasionya: rasio yang stabil dapat menyembunyikan perubahan besar dalam sensitivitas atau penanganan sampel yang perlu diselidiki.

Pilih transisi atau sinyal ion terekstraksi yang terbukti sesuai dengan target dalam matriks sampel. Nilai massa-ke-muatan yang cocok tidak dengan sendirinya merupakan bukti bahwa tidak ada komponen yang mengganggu. Hasil peptida utuh juga tidak boleh diubah menjadi konsentrasi protein induk tanpa membangun hubungan pencernaan dan pemulihan secara terpisah.

Gunakan NMR kuantitatif dengan sinyal dan referensi yang ditetapkan

NMR proton kuantitatif menghubungkan sinyal terintegrasi dari resonansi yang ditetapkan dengan jumlah inti yang berkontribusi dan referensi kuantitatif. Untuk eksperimen referensi internal, hubungan jumlah dapat dinyatakan sebagai:

n _x = n _r × ( Saya _x / N _x ) / ( Saya _r / N _r )

Subskrip x dan r menunjukkan analit dan referensi. I adalah sinyal terintegrasi dan N jumlah proton yang diwakili oleh sinyal tersebut; n _r adalah jumlah referensi yang ditetapkan. Ekspresi ini mengasumsikan respons sinyal yang sebanding secara kuantitatif dan penetapan puncak yang benar. Mengubah hasil menjadi massa peptida memerlukan massa molar berdasarkan dasar pelaporan yang disebutkan.

Li dan rekannya membandingkan qNMR, analisis asam amino, dan HPLC yang dikalibrasi dalam studi kolaboratif bahan referensi peptida. Pekerjaan ini mendemonstrasikan penggunaan praktis qNMR dan juga menunjukkan bahwa perbandingan metode bergantung pada bagaimana standar dan ketidakpastian diperlakukan. Temuannya tidak menetapkan peringkat universal untuk semua sampel peptida. [8]

Selesaikan analit yang dipilih dan sinyal referensi dari pengotor, pelarut, dan satu sama lain. Tetapkan kondisi denyut nadi dan relaksasi yang sesuai, batas sinyal terhadap kebisingan dan integrasi. Panduan BIPM menjelaskan mengapa relaksasi harus dinilai untuk sinyal-sinyal dalam campuran sebenarnya. Referensi pergeseran kimia tidak secara otomatis menjadi standar kuantitatif. Pengotor yang berkerabat dekat berbagi resonansi terintegrasi dapat berkontribusi pada jumlah terukur bahkan ketika integralnya sangat dapat diulang. [9]

8 Tunjukkan rentang kalibrasi

Siapkan tingkat kalibrasi yang mencakup respons sampel yang diinginkan dan nilai model respons yang dipilih. Periksa residu dan konsentrasi yang dihitung kembali dari kurva. Koefisien determinasi yang tinggi, R², tidak dapat dengan sendirinya menghasilkan kalibrasi yang dapat diterima, terutama di dekat batas bawah rentang. Eurachem merekomendasikan untuk mengevaluasi perilaku regresi dan mempertimbangkan pembobotan ketika varians respons berubah seiring dengan konsentrasi. Pilih model menggunakan bukti eksperimental daripada tampilan garis yang diplot. [10]

Gunakan kontrol yang disiapkan secara independen untuk menilai kinerja dalam rentang tersebut. Tetapkan konsentrasi terendah yang dapat mendukung presisi dan bias yang diperlukan; deteksi sinyal saja tidak cukup. Untuk sampel yang memerlukan pengenceran, tunjukkan bahwa pengenceran mempertahankan hasil yang valid. Catat kriteria penerimaan sebelum mengevaluasi urutan sampel dan simpan alasan titik kalibrasi yang dikecualikan. Terapkan kriteria yang sesuai dengan tujuan analitis, tanpa mengimpor batasan numerik dari pengujian yang tidak terkait.

Pisahkan kerugian penanganan dari efek matriks

Evaluasi periode pembubaran, perpindahan dan penyimpanan pada konsentrasi yang digunakan untuk pengukuran. Goebel-Stengel dan rekannya menunjukkan bahwa pemulihan peptida dapat bergantung pada permukaan yang dihubungi. Preparasi sampel independen membantu mengungkap kontribusi ini, sedangkan pengukuran instrumen berulang dari vial yang sama tidak dapat mereproduksi kehilangan preparasi sebelumnya. Bandingkan alikuot segar dan alikuot yang disimpan dan selidiki perolehan setelah penyaringan atau pembersihan. [11]

Untuk LC-MS, perubahan respon dapat mencerminkan perubahan ionisasi yang disebabkan oleh coeluting konstituen sampel. Matuszewski dan rekannya menjelaskan eksperimen yang membedakan efek matriks dari pemulihan ekstraksi. Diterapkan pada metode peptida, perbandingan antara standar yang rapi, ekstrak blanko yang difortifikasi setelah ekstraksi dan sampel yang difortifikasi sebelum ekstraksi dapat membantu memisahkan pengaruh-pengaruh ini, asalkan konsentrasi, volume dan kontribusi endogen ditangani secara konsisten. Evaluasi respons yang dinormalisasi standar internal serta sinyal individual. [12]

Sertakan bagian kosong yang menjawab pertanyaan spesifik. Blanko reagen memeriksa latar belakang yang dimasukkan; kosong setelah sampel pekat memeriksa sisa. Apabila matriks sampel yang benar-benar kosong tidak tersedia, dokumentasikan desain alternatif dan keterbatasannya. Eksperimen lonjakan menilai perolehan kembali material tambahan dalam kondisi yang diuji; hal ini tidak membuktikan bahwa analit yang ada pada awalnya telah diperoleh kembali sepenuhnya atau bebas dari gangguan.

Laporkan hasilnya beserta ketidakpastian dan cakupannya

Penilaian ketidakpastian harus mengikuti model pengukuran dan mencakup kontribusi yang berpengaruh. Hal ini dapat timbul dari penetapan nilai kalibrator, penimbangan dan pengenceran, pemulihan sediaan, kalibrasi, dan kemampuan pengulangan. Perhitungkan masukan dan korelasi bersama jika relevan. Panduan JCGM tentang Ekspresi Ketidakpastian dalam Pengukuran memberikan kerangka kerja untuk menggabungkan informasi tersebut dan melaporkan hasilnya. Deviasi standar yang kecil dari pengukuran berulang hanya menggambarkan variasi yang diwakili oleh pengukuran tersebut. [13]

Laporkan pengidentifikasi sampel dan batch, spesies peptida yang ditentukan, kuantitas terukur, unit, versi metode, dan dasar kalibrasi. Sebutkan jumlah dan jenis sediaan independen dan bagaimana pengenceran atau koreksi perolehan diterapkan. Jika ketidakpastian yang diperluas dilaporkan, identifikasi faktor cakupan dan penafsiran yang dibenarkan oleh evaluasi tersebut. Pertahankan kromatogram atau spektrum yang mendasarinya, keputusan integrasi dan hasil kontrol.

Jika ada perbedaan metode, pertama-tama bandingkan selektivitas kimia dan dasar pelaporannya. Perkiraan berbasis hidrolisat, uji kadar peptida utuh, dan massa bubuk dapat mengacu pada jumlah yang berbeda. Selesaikan perbedaan tersebut sebelum menghubungkan ketidaksepakatan dengan kinerja instrumen. Hasil yang berguna adalah kuantitas yang terikat pada sampel tertentu dan didukung oleh catatan eksperimen yang dapat dilacak.

Ruang lingkup penelitian. Artikel ini membahas kuantifikasi analitis bahan peptida dalam sampel laboratorium. Panduan ini tidak memberikan instruksi untuk penggunaan pada manusia atau hewan dan tidak membuat klaim tentang kemanjuran biologis, kesesuaian klinis, atau persetujuan peraturan. Setiap prosedur pengukuran memerlukan penilaian terhadap sampel yang diinginkan dan tujuan laboratorium.

Referensi

[1] Wang X, Zhang F, Li H, dkk. Penentuan kemurnian glukagon sintetik menggunakan pendekatan keseimbangan massa. Laporan Ilmiah. 2020;10:4423. doi: 10.1038/s41598-020-61109-9

[2] Bunk DM, Lowenthal MS. Kromatografi cair pengenceran isotop-spektrometri massa tandem untuk analisis asam amino kuantitatif. Dalam: Analisis Asam Amino: Metode dan Protokol. edisi ke-2. Metode dalam Biologi Molekuler. 2019;2030. Bab 12. doi: 10.1007/978-1-4939-9639-1_12

[3] Muñoz A, Kral R, Schimmel H. Kuantifikasi kalibrasi protein dengan analisis asam amino menggunakan spektrometri massa pengenceran isotop. Biokimia Analitik. 2011;408(1):124–131. doi: 10.1016/j.ab.2010.08.037

[4] Pusat Informasi Bioteknologi Nasional. Ringkasan Senyawa PubChem untuk CID 750, Glycine. Diakses 2 November 2026. Dokumen sumber

[5] Anthis NJ, Clore GM. Penentuan konsentrasi protein dan peptida secara spesifik berdasarkan serapan pada 205 nm. Ilmu Protein. 2013;22(6):851–858. doi: 10.1002/pro.2253

[6] Kuipers BJH, Gruppen H. Prediksi koefisien kepunahan molar protein dan peptida menggunakan penyerapan UV dari asam amino penyusun pada 214 nm untuk memungkinkan analisis kromatografi cair-spektrometri massa fase balik kuantitatif kinerja tinggi. Jurnal Kimia Pertanian dan Pangan. 2007;55(14):5445–5451. doi: 10.1021/jf070337l

[7] Stoyanov AV, Rogatsky E, Stein D, dkk. Uji pengenceran isotop dalam kuantifikasi peptida: Tantangan mikroheterogenitas standar internal. Aplikasi Klinis Proteomik. 2013;7(11–12):825–828. doi: 10.1002/prca.201200130

[8] Li C, Bhavaraju S, Melanson JE, dkk. Survei metode kuantifikasi peptida dan perbandingan reproduktifitasnya: Studi kasus menggunakan oksitosin. Jurnal Analisis Farmasi dan Biomedis. 2019;166:105–112. doi: 10.1016/j.jpba.2018.12.028

[9] Westwood S, Stoppacher N, Martos G, dkk. Data Referensi Standar Internal untuk qNMR: Asam 3,5-Bis(trifluorometil)benzoat. Hubungan BIPM-2019/02, ISRD-05. Versi 1.0; 13 Maret 2019. Bagian 3. Dokumen sumber

[10] Cantwell H, penyunting. Kesesuaian Tujuan Metode Analisis: Panduan Laboratorium untuk Validasi Metode dan Topik Terkait. edisi ke-3. Eurakhem; 2025. Bagian 5.2–5.4. Dokumen sumber

[11] Goebel-Stengel M, Stengel A, Taché Y, Reeve JR Jr. Pentingnya menggunakan peralatan plastik dan gelas yang optimal dalam penelitian yang melibatkan peptida. Biokimia Analitik. 2011;414(1):38–46. doi: 10.1016/j.ab.2011.02.009

[12] Matuszewski BK, Constanzer ML, Chavez-Eng CM. Strategi penilaian efek matriks dalam metode bioanalitik kuantitatif berdasarkan HPLC-MS/MS. Kimia Analitik. 2003;75(13):3019–3030. doi: 10.1021/ac020361s

[13] Komite Gabungan Pemandu Metrologi. Evaluasi Data Pengukuran: Panduan Ekspresi Ketidakpastian dalam Pengukuran. JCGM 100:2008. Versi yang diperbaiki 2010. Bagian 4–7. Dokumen sumber

SEMUA ARTIKEL DAN INFORMASI PRODUK YANG DISEDIAKAN DALAM WEBSITE INI SEPENUHNYA UNTUK PENYEBARAN INFORMASI DAN TUJUAN PENDIDIKAN.

Produk yang disediakan di situs ini ditujukan khusus untuk penelitian in vitro. Penelitian in vitro (bahasa Latin: *in glass*, artinya barang pecah belah) dilakukan di luar tubuh manusia. Produk-produk ini bukan obat-obatan, belum disetujui oleh Badan Pengawas Obat dan Makanan AS (FDA), dan tidak boleh digunakan untuk mencegah, mengobati, atau menyembuhkan kondisi medis, penyakit, atau penyakit apa pun. Dilarang keras oleh hukum untuk memasukkan produk ini ke dalam tubuh manusia atau hewan dalam bentuk apapun.