Kirjailija: Cocer Peptides          26 päivää sitten.

Abstrakti

Kvantitatiivinen peptiditulos vaatii määritellyn kemiallisen lajin, asianmukaisen kalibrointipohjan ja näyttöä siitä, että näytteen käsittely säilyttää mitattavan määrän. Jauhemassa, kromatografisen pinta-alan prosenttiosuus ja tavoitepeptidipitoisuus kuvaavat erilaisia ​​ominaisuuksia. Niiden käsitteleminen keskenään vaihdettavina voi aiheuttaa virheen ennen ensimmäistä mittausta. Tässä artikkelissa tarkastellaan aminohappoanalyysiä, ultraviolettiabsorbanssia, kalibroitua nestekromatografiaa, isotooppilaimennusmassaspektrometriaa ja kvantitatiivista ydinmagneettista resonanssia lähestymistapoina peptidien kvantifiointiin. Se selittää kunkin menetelmän antamat tiedot, oletukset, joita tarvitaan signaalin muuntamiseen määräksi, ja tulkittavissa olevan tuloksen edellyttämät säädöt. Keskustelu koskee laboratoriomateriaaleja ja analyyttisiä ratkaisuja. Se tarjoaa puitteet mittausmenettelyn valitsemiselle ja arvioimiselle ilman yleisiä käyttöehtoja tai hyväksymisrajoja.

Määritä mitattava määrä

Määritä mittaussuure eli mitattava määrä ennen laitteen valintaa. Esimerkkejä ovat koskemattoman peptidin määrä alikvootissa, sen massakonsentraatio valmistetussa liuoksessa tai sen massaosuus kiinteässä näytteessä sellaisena kuin se on vastaanotettu. Tunnista järjestys, pääteryhmät ja asiaankuuluvat muutokset. Ilmoita, sisältääkö ilmoitettu massa vastaioneja vai kuvaako se pelkän peptidiosan. Tulos tarvitsee myös määritellyn näyterajan: liuenneen osan, koko valmisteen tai tietyn toimenpiteen jälkeen talteen otettu materiaali.

Punnittu kiinteä aine voi sisältää vettä, vastaioneja, jäännösliuottimia ja muita komponentteja. Ultraviolettikromatogrammin suuri kohdepiikki ei mittaa kaikkia näitä ainesosia. Wang ja kollegat osoittivat massatasapainon lähestymistapaa, jossa useiden epäpuhtausluokkien mittaukset yhdistettiin synteettisen peptidimateriaalin luonnehtimiseksi. Tämä havainnollistaa, miksi kromatografisen pinta-alan prosenttiosuutta ei voida automaattisesti korvata peptidin massafraktiolla kvantitatiivista standardia valmistettaessa. [1]

Määritä kalibrointiperusta

Kalibraattori tarvitsee määritetyn suuren, joka on sopiva mittaukseen, sekä sen epävarmuus ja olosuhteet, joissa kyseistä määritystä sovelletaan. Tarkista todistuksesta tarkka erä, kemiallinen muoto, arvopohja ja käsittelyohjeet. Leima, joka ilmoittaa kromatografisen puhtauden, ei yksin anna tavoitepitoisuutta. Bunk ja Lowenthal kuvaavat isotooppilaimennusaminohappoanalyysin käyttöä NIST:ssä tukemaan peptidien ja proteiinien vertailumateriaalien pitoisuusmäärityksiä. Tällainen toimeksianto edellyttää dokumentoitua mittausmenettelyä nimellisjauheen painon sijaan. [2]

Liuokselle, joka on valmistettu kvantitatiivisesti materiaalista, jolla on vahvistettu tavoitemassaosuus, massapitoisuus on:

ρ = m × w / V

Tässä m on punnitun materiaalin massa, w on sen kohdepeptidimassaosuus samalla perusteella ja V on lopullinen liuoksen tilavuus. Jos m on milligrammoina, w milligrammoina milligrammoina ja V millilitroina, ρ on milligrammoina millilitraa kohti. Laskelma olettaa täydellisen liukenemisen ja siirtymisen. Se ei vahvista näitä toimintoja. Muuntaminen määräpitoisuudeksi vaatii nimenomaisesti määritellyn kemiallisen lajin moolimassan.

Valmistele riippumaton tarkistusratkaisu, kun se on mahdollista. Kalibrointistandardit ja tarkastukset, jotka on johdettu yhdestä väärin osoitetusta kalustosta, voivat sopia keskenään, mutta kantavat saman virheen. Säilytä varaston valmistus- ja laimennusasiakirjat, jotta jokaisen määritetyn pitoisuuden lähde voidaan rekonstruoida.

Valitse menetelmä, jolla on riittävä kemiallinen selektiivisyys

Valitse menetelmä näytteen koostumuksen, odotetun pitoisuuden ja kokeeseen tarvittavan epävarmuuden mukaan. Suhteellisen puhdas vertailumateriaali ja useita samankaltaisia ​​peptidejä sisältävä seos aiheuttavat erilaisia ​​mittausongelmia. Taulukossa 1 verrataan alla käsiteltyjä päävaihtoehtoja. Rajoittava kysymys on, voidaanko mitattu vaste riittävällä varmuudella liittää määriteltyyn kohteeseen.

Taulukko 1 Mittausvaihtoehdot ja niiden päärajoitukset

Yhdistä aminohappojen mittaukset peptidimäärään

Aminohappoanalyysi muuntaa ensin peptidin mitattavissa oleviksi aminohapoiksi. Jäännökselle, joka esiintyy ν _i kertaa sekvenssissä, havaittu määrä n _i vastaisi peptidimäärää n _i / y _i, jos vapautuminen olisi täydellinen eikä mikään muu lähde tuottaisi tätä aminohappoa. Vertaa useiden sopivien tähteiden arvioita, jos sekvenssi sen sallii. Erimielisyys voi paljastaa ongelman, jonka keskiarvon laskeminen muuten peittäisi.

Hydrolyysin on vapautettava valitut jäännökset ilman, että mitatut aminohapot häviävät tai muuttuvat kohtuuttomasti. Bunk ja Lowenthal korostavat, että nämä olosuhteet edellyttävät validointia jokaiselle analyytille. Muñoz ja kollegat arvioivat useita aminohappoja kvantifioidessaan proteiinikalibrantteja isotooppilaimennuksella, tarjoten kokeellisen esimerkin jäännöspohjaisten arvioiden välisen yhteisymmärryksen käyttämisestä hydrolyysin arvioinnissa. Yhdelle materiaalille asetettuja olosuhteita ei pitäisi olettaa riittävinä toiselle peptidille. [2,3]

Vapaat aminohapot ja muut peptidit voivat edistää hydrolysaattia. Tästä johtuen pelkkä aminohappoanalyysi voi määrittää koostumukseen liittyvän kokonaissisällön ilman, että aiottua ehjää sekvenssiä kvantifioidaan valikoivasti. Sisällytä sopivat hydrolyysin aihiot ja tutki nämä vaikutukset ennen tavoitearvon määrittämistä. Käytä vapaan aminohapon kemiallista identiteettiä ja muotoa kalibraattorin määriä laskettaessa. Esimerkiksi PubChem tunnistaa glysiinin CID 750:ksi; tietokantatietue tukee identiteetin tarkistusta, mutta ei varmenna aminohappoviitemateriaalin sisältöä. [4]

Tulkitse ultraviolettimittaukset sekvenssin kautta

Homogeeniselle liuokselle sopivalla instrumenttialueella Beer–Lambert-suhde A = εlc yhdistää nollakokeen korjatun absorbanssin A molaariseen absorptiokykyyn ε, optisen polun pituuteen l ja määräpitoisuuteen c. Absorptiokyvyn on vastattava peptidiä, aallonpituutta ja mittausolosuhteita. Absorbanssi lähellä 280 nm riippuu voimakkaasti aromaattisista tähteistä, eikä se voi toimia yleisenä pitoisuusmittauksena jokaiselle peptidille. Anthis ja Clore kehittivät sekvenssipohjaisen lähestymistavan 205 nm:ssä, joka näyttää koostumuksen huomioon ottamisen arvon yhden muuntokertoimen soveltamisen sijaan. [5]

Lyhyemmillä aallonpituuksilla liuottimen ja puskurin absorptio voi tulla rajoittavaksi. Käytä koostumukseen sopivaa aihiota, tarkista käytettävissä oleva optinen alue ja vertaa sopivia laimennuksia. Sameus tai absorboiva epäpuhtaus voi aiheuttaa näennäisen konsentraatiomuutoksen, joka ei liity kohteeseen. Suoraan absorbanssitulokseen tulisi siksi sisältyä ne näytteen koostumukseen liittyvät oletukset, joista se riippuu.

Kromatografinen erotus voi parantaa selektiivisyyttä ennen UV-mittausta, mutta kvantitatiivinen LC-määritys vaatii silti sopivan vastesuhteen. Kuipers ja Gruppen mittasivat aminohappojen ja peptidisidosten erilaisen osuuden absorbanssista 214 nm:ssä. Heidän havainnot selittävät, miksi eri peptidien yhtäläisten piikkialueiden ei tarvitse edustaa yhtä suuria määriä. Tavoitteen kvantifiointia varten vertaa määritettyä kohdevastetta sopiviin määritettyihin standardeihin ja tarkista kalibrointi todellisissa analyyttisissä olosuhteissa. [6]

Arvioi sisäinen standardi isotooppilaimennoksessa LC-MS

Isotooppilaimennoksessa LC–MS kohteen vastetta verrataan lisätyn isotooppisesti leimatun vastineen vasteeseen määritellyn kalibrointimallin avulla. Vahvista kyseisen standardin tunnistetiedot, määrätty määrä ja isotooppikoostumus. Tutki kromatografista vastaavuutta, relevantteja ionikanavia ja mahdollista leimaamattoman materiaalin vaikutusta kohdekanavaan. Stoyanov ja kollegat havainnollistavat, kuinka peptidien sisäisten standardien huomioimaton heterogeenisyys voi vääristää tuloksena olevaa kohdepitoisuutta. Pelkkä merkintä ei anna luotettavaa kvantitatiivista vertailua. [7]

Lisää sisäinen standardi siinä vaiheessa, joka soveltuu sille häviöille, joita sillä on tarkoitus seurata, ja varmista, että se käyttäytyy riittävän analyytin tavoin. Poiston jälkeen käyttöön otettu standardi ei voi korjata tuon louhinnan aikana syntyneitä häviöitä. Jopa varhainen lisäys vaatii riittävää sekoittamista ja vertailukelpoista käyttäytymistä. Säilytä sekä absoluuttiset vasteet että niiden suhde: vakaa suhde voi kätkeä suuria muutoksia herkkyydessä tai näytteen käsittelyssä, jotka ansaitsevat tutkimuksen.

Valitse siirtymät tai erotetut ionisignaalit, jotka ovat todistetusti sopivia näytematriisin kohteelle. Vastaava massa-varausarvo ei sinänsä ole todiste siitä, että häiritsevää komponenttia ei ole. Koskematonta peptiditulosta ei myöskään pitäisi muuttaa emoproteiinipitoisuudeksi ilman, että määritetään erikseen digestio- ja talteenottosuhteet.

Käytä kvantitatiivista NMR:ää määritettyjen signaalien ja referenssien kanssa

Kvantitatiivinen protoni-NMR suhteuttaa osoitetun resonanssin integroidun signaalin myötävaikuttavien ytimien lukumäärään ja kvantitatiiviseen referenssiin. Sisäisessä vertailukokeessa määräsuhde voidaan ilmaista seuraavasti:

n _x = n _r × ( I _x / N _x ) / ( I _r / N _r )

Alaindeksit x ja r tarkoittavat analyyttiä ja referenssiä. I on integroitu signaali ja N tämän signaalin edustamien protonien lukumäärä; n _r on annettu viitemäärä. Lauseke olettaa kvantitatiivisesti vertailukelpoisen signaalivasteen ja oikean piikin osoituksen. Tuloksen muuntaminen peptidimassaksi vaatii moolimassan ilmoitetulla raportointiperusteella.

Li ja kollegat vertasivat qNMR:ää, aminohappoanalyysiä ja kalibroitua HPLC:tä peptidivertailumateriaalin yhteistutkimuksessa. Työ osoitti qNMR:n käytännön käyttöä ja osoitti myös, että menetelmävertailut riippuvat siitä, miten standardeja ja epävarmuustekijöitä käsitellään. Sen havainnot eivät muodosta yleistä sijoitusta kaikille peptidinäytteille. [8]

Erottele valitut analyytit ja vertailusignaalit epäpuhtauksista, liuottimesta ja toisistaan. Määritä sopivat pulssi- ​​ja rentoutumisolosuhteet, signaali-kohina- ja integraatiorajat. BIPM-opastus selittää, miksi relaksaatio on arvioitava todellisen seoksen signaalien osalta. Kemiallisen siirtymän viite ei ole automaattisesti kvantitatiivinen standardi. Läheisesti liittyvät epäpuhtaudet, jotka jakavat integroidun resonanssin, voivat myötävaikuttaa mitattuun määrään, vaikka integraali on erittäin toistettavissa. [9]

8 Näytä kalibrointialue

Valmistele kalibrointitasot, jotka kattavat aiotun näytevasteen, ja arvioi valittu vastemalli. Tarkastele jäännöksiä ja käyrästä takaisin laskettuja pitoisuuksia. Korkea määrityskerroin, R², ei voi itsessään muodostaa hyväksyttävää kalibrointia, etenkään lähellä alueen alempia ääripäitä. Eurachem suosittelee regressiokäyttäytymisen arvioimista ja painotuksen harkitsemista silloin, kun vastevarianssi muuttuu keskittymisen myötä. Valitse malli käyttämällä kokeellista näyttöä piirretyn viivan ulkonäön sijaan. [10]

Käytä itsenäisesti valmistettuja kontrolleja arvioidaksesi suorituskykyä alueella. Määritä pienin pitoisuus, jolla vaadittua tarkkuutta ja harhaa voidaan tukea; pelkkä signaalin havaitseminen ei riitä. Laimennusta vaativien näytteiden osalta osoitetaan, että laimennus säilyttää pätevän tuloksen. Kirjaa hyväksymiskriteerit muistiin ennen näytesekvenssin arviointia ja säilytä syy poissuljetuille kalibrointipisteille. Käytä analyyttiseen tarkoitukseen sopivia kriteerejä tuomatta numeerisia rajoja asiaankuulumattomasta määrityksestä.

Erottele käsittelyhäviöt matriisivaikutuksista

Arvioi liukeneminen, siirrot ja säilytysajat mittauksessa käytetyillä pitoisuuksilla. Goebel-Stengel ja kollegat osoittivat, että peptidien talteenotto voi riippua kosketuksessa olevasta pinnasta. Riippumattomat näytteen valmistelut auttavat paljastamaan tämän vaikutuksen, kun taas toistuvat mittaukset samasta injektiopullosta eivät voi toistaa aikaisempaa valmistushävikkiä. Vertaa sopivia tuoreita ja säilytettyjä alikvootteja ja tutki talteenottoa minkä tahansa suodatuksen tai puhdistuksen jälkeen. [11]

LC-MS:ssä vasteen muutos voi heijastaa ionisaatiomuutosta, joka johtuu näytteen yhdessä eluoituvista ainesosista. Matuszewski ja kollegat kuvasivat kokeita, jotka erottavat matriisivaikutukset uuttamisen talteenotosta. Peptidimenetelmään sovellettaessa vertailut puhtaiden standardien, uuttamisen jälkeen vahvistettujen nollauutteiden ja ennen uuttamista vahvistettujen näytteiden välillä voivat auttaa erottamaan nämä vaikutukset, edellyttäen että pitoisuuksia, tilavuuksia ja endogeenisiä vaikutuksia käsitellään johdonmukaisesti. Arvioi sisäisen standardin mukaan normalisoitu vaste sekä yksittäiset signaalit. [12]

Lisää tyhjiä kohtia, jotka vastaavat tiettyihin kysymyksiin. Reagenssin nollakoe tutkii lisättyä taustaa; nollakoe tiivistetyn näytteen jälkeen tutkii siirtymisen. Jos todella tyhjää näytematriisia ei ole saatavilla, dokumentoi vaihtoehtoinen malli ja sen rajoitukset. Piikkikoe arvioi lisätyn materiaalin talteenoton testatuissa olosuhteissa; se ei todista, että alunperin läsnä ollut analyytti oli täysin talteenotettu tai häiriötön.

Raportoi tulos sen epävarmuudella ja laajuudella

Epävarmuusarvioinnin tulee noudattaa mittausmallia ja sisältää vaikuttavat tekijät. Nämä voivat johtua kalibraattorin arvon määrittämisestä, punnitsemisesta ja laimentamisesta, valmisteen talteenotosta, kalibroinnista ja toistettavuudesta. Ota huomioon yhteiset syötteet ja korrelaatiot tarvittaessa. JCGM Guide to the Expression of Uncertainty in Measurement tarjoaa puitteet tällaisten tietojen yhdistämiselle ja tulosten raportoinnille. Pieni standardipoikkeama toistuvista mittauksista kuvaa vain näiden mittausten edustamaa vaihtelua. [13]

Ilmoita näyte- ja erätunnisteet, määritellyt peptidilajit, mitattu määrä, yksikkö, menetelmän versio ja kalibrointiperuste. Ilmoitetaan riippumattomien valmisteiden lukumäärä ja tyyppi sekä laimennus- tai talteenottokorjaus. Jos laajennettu epävarmuus raportoidaan, selvitä kattavuustekijä ja arvioinnin perustellut tulkinta. Säilytä alla olevat kromatogrammit tai spektrit, integrointipäätökset ja kontrollitulokset.

Jos menetelmät ovat eri mieltä, vertaa ensin niiden kemiallista selektiivisyyttä ja raportointiperusteita. Hydrolysaattiin perustuva arvio, erotettu ehjä peptidimääritys ja jauhemassa voivat viitata eri määriin. Ratkaise tämä ero ennen kuin luet erimielisyyden instrumentin toimivuuteen. Hyödyllinen tulos on määrä, joka on sidottu määritettyyn näytteeseen ja jota tuetaan jäljitettävällä kokeellisella tietueella.

Tutkimuksen laajuus. Tämä artikkeli koskee peptidimateriaalien analyyttistä kvantifiointia laboratorionäytteissä. Se ei sisällä ohjeita ihmisten tai eläinlääketieteelliseen käyttöön eikä väitä biologista tehoa, kliinistä soveltuvuutta tai viranomaishyväksyntää. Jokainen mittausmenettely edellyttää arvioinnin aiotun näytteen ja laboratorion tavoitteen osalta.

Viitteet

[1] Wang X, Zhang F, Li H, et ai. Synteettisen glukagonin puhtauden määritys massatasapainomenetelmällä. Tieteelliset raportit. 2020; 10:4423. doi: 10.1038/s41598-020-61109-9

[2] Bunk DM, Lowenthal MS. Isotooppilaimennusnestekromatografia-tandemmassaspektrometria kvantitatiiviseen aminohappoanalyysiin. Julkaisussa: Amino Acid Analysis: Methods and Protocols. 2. painos Molekyylibiologian menetelmät. 2019; 2030. Luku 12. doi: 10.1007/978-1-4939-9639-1_12

[3] Muñoz A, Kral R, Schimmel H. Proteiinikalibranttien kvantifiointi aminohappoanalyysillä käyttäen isotooppilaimennusmassaspektrometriaa. Analyyttinen biokemia. 2011; 408(1):124–131. doi: 10.1016/j.ab.2010.08.037

[4] National Center for Biotechnology Information. PubChem Compound Summary for CID 750, Glycine. Käytetty 2.11.2026. Lähdedokumentti

[5] Anthis NJ, Clore GM. Proteiini- ja peptidipitoisuuksien sekvenssispesifinen määritys absorbanssilla 205 nm:ssä. Proteiinitiede. 2013;22(6):851–858. doi: 10.1002/pro.2253

[6] Kuipers BJH, Gruppen H. Proteiinien ja peptidien molaaristen ekstinktiokertoimien ennustaminen käyttämällä osa-aminohappojen UV-absorptiota 214 nm:ssä kvantitatiivisen käänteisfaasin korkean suorituskyvyn nestekromatografia-massaspektrometria-analyysin mahdollistamiseksi. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2007;55(14):5445–5451. doi: 10.1021/jf070337l

[7] Stoyanov AV, Rogatsky E, Stein D, et ai. Isotooppilaimennusmääritys peptidien kvantifiointiin: sisäisen standardin mikroheterogeenisuuden haaste. Proteomiikan kliiniset sovellukset. 2013;7(11–12):825–828. doi: 10.1002/prca.201200130

[8] Li C, Bhavaraju S, Melanson JE, et ai. Peptidien kvantifiointimenetelmien selvitys ja niiden toistettavuuden vertailu: Tapaustutkimus oksitosiinilla. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2019; 166:105–112. doi: 10.1016/j.jpba.2018.12.028

[9] Westwood S, Stoppacher N, Martos G, et ai. Sisäiset standardiviitetiedot qNMR:lle: 3,5-bis(trifluorimetyyli)bentsoehappo. Raportti BIPM-2019/02, ISRD-05. Versio 1.0; 13. maaliskuuta 2019. Osa 3. Lähdedokumentti

[10] Cantwell H, toim. Analyyttisten menetelmien käyttötarkoitus: Laboratorioopas menetelmien validoinnista ja siihen liittyvistä aiheista. 3. painos Eurachem; 2025. Kohdat 5.2–5.4. Lähdedokumentti

[11] Goebel-Stengel M, Stengel A, Taché Y, Reeve JR Jr. Optimaalisten muovi- ja lasiesineiden käytön tärkeys peptidejä koskevissa tutkimuksissa. Analyyttinen biokemia. 2011;414(1):38–46. doi: 10.1016/j.ab.2011.02.009

[12] Matuszewski BK, Constanzer ML, Chavez-Eng CM. Strategiat matriisivaikutuksen arvioimiseksi kvantitatiivisissa bioanalyyttisissa menetelmissä, jotka perustuvat HPLC-MS/MS:ään. Analyyttinen kemia. 2003;75(13):3019–3030. doi: 10.1021/ac020361s

[13] Metrologian oppaiden sekakomitea. Mittaustietojen arviointi: Opas mittauksen epävarmuuden ilmaisemiseen. JCGM 100:2008. Korjattu versio 2010. Osat 4–7. Lähdedokumentti

KAIKKI TÄLLÄ VERKKOSIVUSTOLLA TARKOITETUT ARTIKKELI JA TUOTETIEDOT ON AINOASTAAN TIEDON LEVITTÄMISTÄ JA KOULUTUSTARKOITUKSISTA.

Tällä sivustolla olevat tuotteet on tarkoitettu yksinomaan in vitro -tutkimukseen. In vitro -tutkimusta (latinaksi: *in glass*, tarkoittaa lasitavaroita) tehdään ihmiskehon ulkopuolella. Nämä tuotteet eivät ole lääkkeitä, niitä ei ole hyväksynyt Yhdysvaltain elintarvike- ja lääkevirasto (FDA), eikä niitä saa käyttää minkään sairauden, sairauden tai vaivan ehkäisyyn, hoitoon tai parantamiseen. Näiden tuotteiden vieminen ihmisen tai eläimen kehoon missään muodossa on lailla ehdottomasti kiellettyä.