Od Cocer Peptides 
před 26 dny.
Kvantitativní výsledek peptidu vyžaduje definovaný chemický druh, vhodný kalibrační základ a důkaz, že manipulace se vzorkem zachovává měřené množství. Hmotnost prášku, procento chromatografické plochy a koncentrace cílového peptidu popisují různé vlastnosti. Považovat je za zaměnitelné může způsobit chybu před provedením prvního měření. Tento článek zkoumá analýzu aminokyselin, ultrafialovou absorbanci, kalibrovanou kapalinovou chromatografii, izotopovou diluční hmotnostní spektrometrii a kvantitativní nukleární magnetickou rezonanci jako přístupy ke kvantifikaci peptidů. Vysvětluje informace, které každá metoda poskytuje, předpoklady potřebné k převodu jejího signálu na množství a ovládací prvky potřebné pro interpretovatelný výsledek. Diskuse se týká laboratorních materiálů a analytických řešení. Poskytuje rámec pro výběr a posouzení postupu měření, aniž by předepisoval univerzální provozní podmínky nebo limity přijatelnosti.
Před výběrem přístroje specifikujte měřenou veličinu, tedy veličinu, která má být měřena. Příklady zahrnují množství intaktního peptidu v alikvotu, jeho hmotnostní koncentraci v připraveném roztoku nebo jeho hmotnostní zlomek v pevném vzorku tak, jak byl přijat. Identifikujte sekvenci, skupiny terminálů a příslušné modifikace. Uveďte, zda uvedená hmotnost zahrnuje protiionty nebo popisuje samotnou peptidovou skupinu. Výsledek také potřebuje definovanou hranici vzorku: rozpuštěný podíl, celý přípravek nebo materiál získaný po určité operaci.
Vážená pevná látka může obsahovat vodu, protiionty, zbytková rozpouštědla a další složky. Velký cílový pík v ultrafialovém chromatogramu neměří všechny tyto složky. Wang a kolegové demonstrovali přístup k hmotnostní bilanci, který kombinoval měření několika tříd nečistot k charakterizaci syntetického peptidového materiálu. To ilustruje, proč nelze při přípravě kvantitativního standardu automaticky nahradit hmotnostní frakci peptidu procento chromatografické plochy. [1]
Kalibrátor potřebuje přiřazenou veličinu vhodnou k měření, spolu s její nejistotou a podmínkami, za kterých toto přiřazení platí. Zkontrolujte certifikát pro přesnou šarži, chemickou formu, hodnotový základ a pokyny pro manipulaci. Samotná značka uvádějící chromatografickou čistotu neposkytuje cílovou koncentraci. Bunk a Lowenthal popisují použití izotopové diluční analýzy aminokyselin v NIST pro podporu přiřazení koncentrací pro peptidové a proteinové referenční materiály. Takové přiřazení vyžaduje dokumentovaný postup měření spíše než nominální hmotnost prášku. [2]
Pro roztok připravený kvantitativně z materiálu se stanoveným cílovým hmotnostním zlomkem je hmotnostní koncentrace:
ρ = m × š / V
Zde m je hmotnost váženého materiálu, w je hmotnostní frakce cílového peptidu na stejném základě a V je konečný objem roztoku. Je-li m v miligramech, w v miligramech na miligram a V v mililitrech, ρ je v miligramech na mililitr. Výpočet předpokládá úplné rozpuštění a přenos. Tyto operace neověřuje. Přepočet na koncentraci množství vyžaduje molární hmotnost explicitně definovaného chemického druhu.
Je-li to možné, připravte nezávislé kontrolní řešení. Kalibrační etalony a kontroly odvozené z jedné nesprávně přiřazené zásoby se mohou vzájemně shodovat a nést stejnou chybu. Uchovejte záznamy o přípravě a ředění zásobního roztoku, aby bylo možné rekonstruovat zdroj každé přiřazené koncentrace.
Metodu zvolte podle složení vzorku, očekávané koncentrace a nejistoty potřebné pro experiment. Relativně čistý referenční materiál a směs obsahující několik příbuzných peptidů představují různé problémy měření. Tabulka 1 porovnává hlavní možnosti uvedené níže. Omezující otázkou je, zda lze naměřenou odezvu přiřadit definovanému cíli s dostatečnou spolehlivostí.
Tabulka 1 Možnosti měření a jejich hlavní omezení
Metoda |
Základ kvantifikace |
Omezení vyšetřovat |
Aminokyselinová analýza |
Množství uvolněných aminokyselin související se složením sekvence. |
Úplnost hydrolýzy a příspěvky jiných peptidů nebo volných aminokyselin. |
Přímá UV absorbce |
Absorbance související s koncentrací prostřednictvím vhodné absorpce. |
Sekvenční závislost, pohlcování kontaminantů a optické pozadí. |
Kalibrovaný LC s UV detekcí |
Cílová maximální odezva ve srovnání s přiřazenými peptidovými standardy. |
Nevyřešené komponenty a rozdíly v reakci nebo výtěžnosti vzorku. |
Izotopové ředění LC–MS |
Odezva analytu ve vztahu k charakterizovanému vnitřnímu standardu značenému izotopem. |
Interference, maticové efekty a přiřazené množství vnitřního standardu. |
Kvantitativní NMR |
Signální integrály týkající se počtu jader a kvantitativní reference. |
Vhodnost překrytí signálu, relaxace a reference. |
Analýza aminokyselin nejprve převede peptid na měřitelné základní aminokyseliny. Pro zbytek vyskytující se v i krát v sekvenci by pozorované množství n i odpovídalo množství n i v / i peptidu , pokud by uvolňování bylo úplné a žádný jiný zdroj nepřispěl k této aminokyselině. Porovnejte odhady z několika vhodných zbytků, pokud to sekvence umožňuje. Nesouhlas může odhalit problém, který by jinak průměrování skrývalo.
Hydrolýza musí uvolnit vybrané zbytky bez nepřijatelné ztráty nebo konverze měřených aminokyselin. Bunk a Lowenthal zdůrazňují, že tyto podmínky vyžadují validaci pro každý analyt. Muñoz a kolegové hodnotili několik aminokyselin při kvantifikaci proteinových kalibrátorů izotopovým ředěním, což poskytuje experimentální příklad použití shody mezi odhady založenými na zbytcích k posouzení hydrolýzy. Podmínky stanovené pro jeden materiál by neměly být považovány za adekvátní pro jiný peptid. [2,3]
K hydrolyzátu mohou přispívat volné aminokyseliny a další peptidy. V důsledku toho může samotná analýza aminokyselin stanovit celkový obsah související se složením bez selektivní kvantifikace zamýšlené neporušené sekvence. Před přiřazením cílové hodnoty zahrňte vhodné hydrolyzační slepé vzorky a prozkoumejte tyto příspěvky. Při výpočtu množství kalibrátoru použijte chemickou identitu a formu volné aminokyseliny. Například PubChem identifikuje glycin jako CID 750; záznam databáze podporuje kontrolu identity, ale necertifikuje obsah referenčního materiálu pro aminokyseliny. [4]
Pro homogenní roztok ve vhodném instrumentálním rozsahu spojuje Beer–Lambertův vztah A = εlc absorbanci A korigovanou na slepý pokus s molární absorptivitou ε, délkou optické dráhy l a koncentrací c. Absorptivita musí odpovídat peptidu, vlnové délce a podmínkám měření. Absorbance blízko 280 nm silně závisí na aromatických zbytcích a nemůže sloužit jako obecné měření koncentrace pro každý peptid. Anthis a Clore vyvinuli sekvenční přístup při 205 nm, který ukazuje hodnotu zohlednění složení spíše než použití jediného konverzního faktoru. [5]
Při kratších vlnových délkách může být absorpce rozpouštědla a pufru limitující. Použijte blank se shodným složením, zkontrolujte použitelný optický rozsah a porovnejte vhodná ředění. Zákal nebo absorbující nečistota mohou způsobit zjevnou změnu koncentrace nesouvisející s cílem. Výsledek přímé absorbance by proto měl nést předpoklady o složení vzorku, na kterém závisí.
Chromatografická separace může zlepšit selektivitu před UV měřením, ale kvantitativní LC test stále vyžaduje vhodný vztah odezvy. Kuipers a Gruppen měřili různé příspěvky aminokyselin a peptidových vazeb k absorbanci při 214 nm. Jejich zjištění vysvětlují, proč stejné plochy píku z různých peptidů nemusí představovat stejná množství. Pro kvantifikaci cíle porovnejte vyřešenou cílovou odezvu s vhodně přiřazenými standardy a ověřte kalibraci za skutečných analytických podmínek. [6]
V izotopovém ředění LC–MS se odezva cíle porovnává s odezvou přidaného izotopově značeného protějšku prostřednictvím definovaného kalibračního modelu. Potvrďte identitu, přidělené množství a izotopové složení tohoto standardu. Prozkoumejte chromatografickou shodu, příslušné iontové kanály a možný příspěvek neznačeného materiálu k cílovému kanálu. Stoyanov a kolegové ilustrovali, jak může nezodpovězená heterogenita v peptidových vnitřních standardech ovlivnit výslednou cílovou koncentraci. Samotné označení nezakládá spolehlivou kvantitativní referenci. [7]
Přidejte vnitřní standard ve fázi odpovídající ztrátám, které má být sledovány, a zjistěte, že se dostatečně chová jako analyt. Norma zavedená po extrakci nemůže korigovat ztráty, ke kterým došlo během této extrakce. I brzký přídavek vyžaduje dostatečné promíchání a srovnatelné chování. Zachovejte jak absolutní odezvy, tak jejich poměr: stabilní poměr může zakrýt velké změny v citlivosti nebo manipulaci se vzorky, které si zaslouží prozkoumání.
Vyberte přechody nebo extrahované iontové signály, které jsou prokazatelně vhodné pro cíl v matrici vzorku. Odpovídající hodnota hmotnosti k nabití není sama o sobě důkazem nepřítomnosti rušivé složky. Výsledek neporušeného peptidu by také neměl být převeden na koncentraci mateřského proteinu bez samostatného stanovení vztahů štěpení a obnovy.
Kvantitativní protonová NMR vztahuje integrovaný signál přiřazené rezonance k počtu přispívajících jader a kvantitativní referenci. U experimentu s interní referencí lze vztah mezi množstvím vyjádřit jako:
n x = n r × ( I x / N x ) / ( I r / N r )
Indexy x a r označují analyt a referenci. I je integrovaný signál a N počet protonů reprezentovaných tímto signálem; n r je přiřazená referenční částka. Exprese předpokládá kvantitativně srovnatelnou odezvu signálu a správné přiřazení píku. Převod výsledku na hmotnost peptidu vyžaduje molární hmotnost na uvedené bázi.
Li a kolegové porovnávali qNMR, analýzu aminokyselin a kalibrovanou HPLC ve společné studii peptidového referenčního materiálu. Práce demonstrovala praktické využití qNMR a také ukázala, že srovnání metod závisí na tom, jak se zachází se standardy a nejistotami. Jeho zjištění nestanoví univerzální hodnocení pro všechny vzorky peptidů. [8]
Vyřešte vybraný analyt a referenční signály od nečistot, rozpouštědla a navzájem. Stanovte vhodné pulzní a relaxační podmínky, signál-šum a integrační hranice. Pokyny BIPM vysvětlují, proč musí být relaxace hodnocena pro signály ve skutečné směsi. Reference chemického posunu není automaticky kvantitativní standard. Úzce příbuzné nečistoty sdílející integrovanou rezonanci mohou přispívat k měřenému množství, i když je integrál vysoce opakovatelný. [9]
Připravte kalibrační úrovně, které pokrývají zamýšlenou odezvu vzorku, a vyhodnoťte zvolený model odezvy. Prozkoumejte zbytky a koncentrace vypočítané zpětně z křivky. Vysoký koeficient determinace, R², nemůže sám o sobě stanovit přijatelnou kalibraci, zejména v blízkosti spodního konce rozsahu. Eurachem doporučuje vyhodnotit regresní chování a zvážit vážení tam, kde se variance odpovědi mění s koncentrací. Vyberte model spíše pomocí experimentálních důkazů než vzhledu vykreslené čáry. [10]
Použijte nezávisle připravené ovládací prvky k posouzení výkonu v rámci rozsahu. Stanovte nejnižší koncentraci, při které lze podpořit požadovanou přesnost a vychýlení; samotná detekce signálu je nedostatečná. U vzorků vyžadujících ředění prokažte, že ředění zachovává platný výsledek. Před vyhodnocením sekvence vzorků si zaznamenejte akceptační kritéria a uchovejte důvod vyloučení kalibračního bodu. Použijte kritéria vhodná pro analytický cíl, bez importu číselných limitů z nesouvisejícího testu.
Vyhodnoťte rozpouštění, přenosy a doby zdržení při koncentracích použitých pro měření. Goebel-Stengel a kolegové prokázali, že obnova peptidu může záviset na kontaktovaném povrchu. Nezávislé přípravy vzorků pomáhají tento příspěvek odhalit, zatímco opakovaná měření přístroje ze stejné lahvičky nemohou reprodukovat dřívější ztrátu preparátu. Porovnejte vhodné čerstvé a zadržené alikvoty a prozkoumejte výtěžnost po jakékoli filtraci nebo čištění. [11]
U LC–MS může změna odezvy odrážet změnu v ionizaci způsobenou koeluujícími složkami vzorku. Matuszewski a kolegové popsali experimenty, které odlišují matricové efekty od extrakčního získávání. Aplikováno na peptidovou metodu, srovnání mezi čistými standardy, slepými extrakty obohacenými po extrakci a vzorky obohacenými před extrakcí může pomoci oddělit tyto vlivy za předpokladu, že koncentrace, objemy a endogenní příspěvky jsou zpracovávány konzistentně. Vyhodnoťte odezvu normalizovanou vnitřním standardem a také jednotlivé signály. [12]
Zahrňte mezery, které odpovídají na konkrétní otázky. Slepý vzorek reagencie zkoumá zavedené pozadí; slepý pokus po koncentrovaném vzorku zkoumá přenos. Pokud není k dispozici skutečně prázdná matrice vzorku, zdokumentujte alternativní návrh a jeho omezení. Experiment s hroty hodnotí výtěžnost přidaného materiálu za testovaných podmínek; neprokazuje to, že původně přítomný analyt byl zcela získán zpět nebo bez interference.
Posouzení nejistoty by se mělo řídit modelem měření a mělo by zahrnovat vlivné příspěvky. Ty mohou vyplývat z přiřazení hodnoty kalibrátoru, vážení a ředění, regenerace přípravy, kalibrace a opakovatelnosti. Zohledněte sdílené vstupy a korelace tam, kde je to relevantní. JCGM Guide to the Expression of Uncertainty in Measurement poskytuje rámec pro kombinování takových informací a vykazování výsledku. Malá standardní odchylka od opakovaných měření popisuje pouze variaci reprezentovanou těmito měřeními. [13]
Uveďte identifikátory vzorku a šarže, definované druhy peptidů, naměřené množství, jednotku, verzi metody a základ kalibrace. Uveďte počet a typ nezávislých přípravků a způsob, jakým bylo použito případné ředění nebo korekce na výtěžnost. Pokud je hlášena rozšířená nejistota, identifikujte faktor pokrytí a interpretaci odůvodněnou hodnocením. Zachovejte základní chromatogramy nebo spektra, rozhodnutí o integraci a výsledky kontroly.
Pokud se metody neshodují, nejprve porovnejte jejich chemickou selektivitu a základ pro podávání zpráv. Odhad založený na hydrolyzátu, rozložený intaktní peptidový test a hmotnost prášku mohou odkazovat na různá množství. Vyřešte tento rozdíl dříve, než přisoudíte nesouhlas výkonu nástroje. Užitečným výsledkem je množství vázané na definovaný vzorek a podpořené sledovatelným experimentálním záznamem.
Rozsah výzkumu. Tento článek se zabývá analytickou kvantifikací peptidových materiálů v laboratorních vzorcích. Neposkytuje žádné pokyny pro humánní nebo veterinární použití a nečiní žádné nároky na biologickou účinnost, klinickou vhodnost nebo schválení regulačními orgány. Každý postup měření vyžaduje posouzení pro zamýšlený vzorek a laboratorní cíl.
[1] Wang X, Zhang F, Li H a kol. Stanovení čistoty syntetického glukagonu pomocí přístupu hmotnostní bilance. Vědecké zprávy. 2020;10:4423. doi: 10.1038/s41598-020-61109-9
[2] Bunk DM, Lowenthal čs. Izotopová zřeďovací kapalinová chromatografie-tandemová hmotnostní spektrometrie pro kvantitativní analýzu aminokyselin. In: Amino Acid Analysis: Methods and Protocols. 2. vyd. Metody v molekulární biologii. 2019; 2030. Kapitola 12. doi: 10.1007/978-1-4939-9639-1_12
[3] Muñoz A, Kral R, Schimmel H. Kvantifikace proteinových kalibrátorů analýzou aminokyselin pomocí izotopové diluční hmotnostní spektrometrie. Analytická biochemie. 2011;408(1):124–131. doi: 10.1016/j.ab.2010.08.037
[4] Národní centrum pro biotechnologické informace. PubChem Compound Summary pro CID 750, glycin. Zpřístupněno 2. listopadu 2026. Zdrojový dokument
[5] Anthis NJ, Clore GM. Sekvenčně specifické stanovení koncentrací proteinu a peptidu absorbancí při 205 nm. Protein Science. 2013;22(6):851–858. doi: 10.1002/pro.2253
[6] Kuipers BJH, Gruppen H. Predikce molárních extinkčních koeficientů proteinů a peptidů pomocí UV absorpce jednotlivých aminokyselin při 214 nm pro umožnění kvantitativní analýzy vysokoúčinné kapalinové chromatografie a hmotnostní spektrometrie s reverzní fází. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2007;55(14):5445–5451. doi: 10.1021/jf070337l
[7] Stoyanov AV, Rogatsky E, Stein D, et al. Test izotopového ředění při kvantifikaci peptidu: Výzva mikroheterogenity vnitřního standardu. Klinické aplikace proteomiky. 2013;7(11–12):825–828. doi: 10.1002/prca.201200130
[8] Li C, Bhavaraju S, Melanson JE a kol. Přehled metod kvantifikace peptidů a srovnání jejich reprodukovatelnosti: Případová studie s použitím oxytocinu. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2019;166:105–112. doi: 10.1016/j.jpba.2018.12.028
[9] Westwood S, Stoppacher N, Martos G, et al. Referenční data vnitřního standardu pro qNMR: kyselina 3,5-bis(trifluormethyl)benzoová. Zpráva BIPM-2019/02, ISRD-05. Verze 1.0; 13. března 2019. Oddíl 3. Zdrojový dokument
[10] Cantwell H, ed. Vhodnost analytických metod pro účel: Laboratorní průvodce validací metod a související témata. 3. vyd. Eurachem; 2025. Sekce 5.2–5.4. Zdrojový dokument
[11] Goebel-Stengel M, Stengel A, Taché Y, Reeve JR Jr. Význam použití optimálního plastového a skleněného nádobí ve studiích zahrnujících peptidy. Analytická biochemie. 2011;414(1):38–46. doi: 10.1016/j.ab.2011.02.009
[12] Matuszewski BK, Constanzer ML, Chavez-Eng CM. Strategie pro hodnocení účinku matrice v kvantitativních bioanalytických metodách založených na HPLC-MS/MS. Analytická chemie. 2003;75(13):3019–3030. doi: 10.1021/ac020361s
[13] Smíšený výbor pro pokyny v metrologii. Vyhodnocení dat měření: Průvodce vyjádřením nejistoty v měření. JCGM 100:2008. Opravená verze 2010. Části 4–7. Zdrojový dokument
VŠECHNY ČLÁNKY A INFORMACE O PRODUKTECH POSKYTOVANÉ NA TOMTO WEBU JSOU VÝHRADNĚ PRO ŠÍŘENÍ INFORMACÍ A VZDĚLÁVACÍ ÚČELY.
Produkty uvedené na této webové stránce jsou určeny výhradně pro výzkum in vitro. Výzkum in vitro (latinsky: *ve skle*, což znamená ve skle) se provádí mimo lidské tělo. Tyto produkty nejsou léčiva, nebyly schváleny americkým Úřadem pro kontrolu potravin a léčiv (FDA) a nesmějí být používány k prevenci, léčbě nebo léčbě jakéhokoli zdravotního stavu, nemoci nebo onemocnění. Vnášení těchto produktů do lidského nebo zvířecího těla v jakékoli formě je zákonem přísně zakázáno.
