Af Cocer Peptides          26 dage siden.

Abstrakt

Et kvantitativt peptidresultat kræver en defineret kemisk art, et passende kalibreringsgrundlag og bevis for, at prøvehåndtering bevarer den mængde, der måles. Pulvermasse, kromatografisk arealprocent og målpeptidkoncentration beskriver forskellige egenskaber. At behandle dem som udskiftelige kan introducere en fejl, før den første måling foretages. Denne artikel undersøger aminosyreanalyse, ultraviolet absorbans, kalibreret væskekromatografi, isotopfortyndingsmassespektrometri og kvantitativ nuklear magnetisk resonans som tilgange til peptidkvantificering. Den forklarer den information, hver metode giver, de forudsætninger, der kræves for at konvertere signalet til en mængde, og de kontroller, der er nødvendige for et fortolkbart resultat. Diskussionen omhandler laboratoriematerialer og analyseløsninger. Det giver en ramme for udvælgelse og vurdering af en måleprocedure uden at foreskrive universelle driftsbetingelser eller acceptgrænser.

Definer den mængde, der skal måles

Angiv måleværdien, dvs. den mængde, der skal måles, før du vælger et instrument. Eksempler inkluderer mængden af ​​et intakt peptid i en alikvot, dets massekoncentration i en forberedt opløsning eller dets massefraktion i en fast prøve som modtaget. Identificer sekvensen, terminalgrupper og relevante modifikationer. Angiv, om den rapporterede masse inkluderer modioner eller beskriver peptiddelen alene. Resultatet kræver også en defineret prøvegrænse: den opløste del, hele præparatet eller materialet genvundet efter en specificeret operation.

Et vejet fast stof kan indeholde vand, modioner, resterende opløsningsmidler og andre komponenter. En stor måltop i et ultraviolet kromatogram måler ikke alle disse bestanddele. Wang og kolleger demonstrerede en massebalance-tilgang, der kombinerede målinger af flere urenhedsklasser for at karakterisere et syntetisk peptidmateriale. Dette illustrerer, hvorfor en kromatografisk arealprocent ikke automatisk kan erstatte peptidmassefraktion ved fremstilling af en kvantitativ standard. [1]

Etabler kalibreringsgrundlaget

En kalibrator har brug for en tildelt mængde, der passer til målingen, sammen med dens usikkerhed og de betingelser, hvorunder denne tildeling gælder. Tjek certifikatet for det nøjagtige parti, kemiske form, værdigrundlag og håndteringsinstruktioner. Et mærke, der angiver kromatografisk renhed alene, giver ikke en målkoncentration. Bunk og Lowenthal beskriver brugen af ​​isotopfortyndingsaminosyreanalyse ved NIST for at understøtte koncentrationstildelinger for peptid- og proteinreferencematerialer. En sådan opgave kræver en dokumenteret måleprocedure frem for en nominel pulvervægt. [2]

For en opløsning fremstillet kvantitativt af et materiale med en etableret målmassefraktion er massekoncentrationen:

ρ = m × w/V

Her er m massen af ​​vejet materiale, w er dets målpeptidmassefraktion på samme basis, og V er det endelige opløsningsvolumen. Hvis m er i milligram, w i milligram per milligram og V i milliliter, er ρ i milligram per milliliter. Beregningen forudsætter fuldstændig opløsning og overdragelse. Det verificerer ikke disse operationer. Konvertering til mængdekoncentration kræver molmassen af ​​den eksplicit definerede kemiske art.

Forbered en uafhængig kontrolløsning, når det er muligt. Kalibreringsstandarder og kontroller afledt af et forkert tildelt lager kan stemme overens med hinanden, mens de bærer den samme fejl. Opbevar stamforberedelses- og fortyndingsregistrene, så kilden til hver tildelt koncentration kan rekonstrueres.

Vælg en metode med tilstrækkelig kemisk selektivitet

Vælg metoden i henhold til prøvesammensætningen, forventet koncentration og usikkerhed, der er nødvendig for eksperimentet. Et relativt rent referencemateriale og en blanding indeholdende flere beslægtede peptider giver forskellige måleproblemer. Tabel 1 sammenligner de vigtigste muligheder diskuteret nedenfor. Det begrænsende spørgsmål er, om den målte respons kan henføres til det definerede mål med tilstrækkelig sikkerhed.

Tabel 1 Målemuligheder og deres væsentligste begrænsninger

Relater aminosyremålinger til peptidmængde

Aminosyreanalyse omdanner først et peptid til målbare aminosyrer. For en rest, der forekommer gange _i sekvensen, ville en observeret mængde ni _, svare til en peptidmængde n _i / νi _νi hvis frigivelsen var fuldstændig, og ingen anden kilde bidrog med den aminosyre. Sammenlign estimater fra flere egnede rester, hvor sekvensen tillader det. Uenighed kan afsløre et problem, som gennemsnitsberegning ellers ville skjule.

Hydrolyse skal frigive de udvalgte rester uden et uacceptabelt tab eller omdannelse af de målte aminosyrer. Bunk og Lowenthal understreger, at disse forhold kræver validering for hver analyt. Muñoz og kolleger evaluerede adskillige aminosyrer, når de kvantificerede proteinkalibranter ved isotopfortynding, hvilket gav et eksperimentelt eksempel på brug af overensstemmelse mellem restbaserede estimater til at vurdere hydrolyse. Betingelserne etableret for et materiale bør ikke antages at være tilstrækkelige for et andet peptid. [2,3]

Frie aminosyrer og andre peptider kan bidrage til hydrolysatet. Følgelig kan aminosyreanalyse alene etablere totalt sammensætningsrelateret indhold uden selektivt at kvantificere den tilsigtede intakte sekvens. Inkluder egnede hydrolyseemner, og undersøg disse bidrag, før du tildeler en målværdi. Brug den frie aminosyres kemiske identitet og form ved beregning af kalibratormængder. For eksempel identificerer PubChem glycin som CID 750; databaseposten understøtter identitetskontrol, men attesterer ikke indholdet af et aminosyrereferencemateriale. [4]

Fortolk ultraviolette målinger gennem sekvensen

For en homogen opløsning inden for et passende instrumentområde forbinder Beer-Lambert-forholdet A = εlc blindprøvekorrigeret absorbans A med molær absorptivitet ε, optisk vejlængde l og mængdekoncentration c. Absorptionsevnen skal svare til peptid, bølgelængde og målebetingelser. Absorbans nær 280 nm afhænger stærkt af aromatiske rester og kan ikke tjene som en generel koncentrationsmåling for hvert peptid. Anthis og Clore udviklede en sekvensbaseret tilgang ved 205 nm, der viser værdien af ​​at tage højde for sammensætning i stedet for at anvende en enkelt konverteringsfaktor. [5]

Ved kortere bølgelængder kan opløsningsmiddel- og bufferabsorption blive begrænsende. Brug et sammensætningsmatchet emne, kontroller det anvendelige optiske område, og sammenlign passende fortyndinger. Turbiditet eller en absorberende urenhed kan frembringe en tilsyneladende koncentrationsændring, der ikke er relateret til målet. Et direkte absorbansresultat bør derfor bære de antagelser om prøvesammensætning, som det afhænger af.

Kromatografisk adskillelse kan forbedre selektiviteten før UV-måling, men en kvantitativ LC-analyse kræver stadig et passende responsforhold. Kuipers og Gruppen målte forskellige bidrag fra aminosyrer og peptidbindinger til absorbans ved 214 nm. Deres resultater forklarer, hvorfor lige store toparealer fra forskellige peptider ikke behøver at repræsentere lige store mængder. For målkvantificering skal du sammenligne det opløste målrespons med passende tildelte standarder og verificere kalibreringen under de faktiske analytiske forhold. [6]

Vurder den interne standard i isotopfortynding LC–MS

I isotopfortynding LC–MS sammenlignes målets respons med responsen for en tilføjet isotopmærket modpart gennem en defineret kalibreringsmodel. Bekræft identiteten, den tildelte mængde og isotopsammensætningen af ​​denne standard. Undersøg kromatografisk korrespondance, relevante ionkanaler og muligt bidrag af umærket materiale til målkanalen. Stoyanov og kolleger illustrerede, hvordan uforklarlig heterogenitet i interne peptidstandarder kan påvirke den resulterende målkoncentration. Mærkning alene etablerer ikke en pålidelig kvantitativ reference. [7]

Tilføj den interne standard på et trin, der passer til de tab, den er beregnet til at spore, og kontroller, at den opfører sig tilstrækkeligt som analytten. En standard introduceret efter en ekstraktion kan ikke korrigere tab, der er opstået under denne ekstraktion. Selv en tidlig tilføjelse kræver tilstrækkelig blanding og sammenlignelig adfærd. Bevar både de absolutte svar og deres forhold: Et stabilt forhold kan skjule store ændringer i følsomhed eller prøvehåndtering, der fortjener undersøgelse.

Vælg overgange eller ekstraherede ion-signaler, der beviseligt er egnede til målet i prøvematrixen. En matchende masse-til-ladning-værdi er ikke i sig selv et bevis på, at en forstyrrende komponent er fraværende. Et intakt peptidresultat bør heller ikke omdannes til en moderproteinkoncentration uden separat at etablere fordøjelses- og gendannelsesforhold.

Brug kvantitativ NMR med tildelte signaler og referencer

Kvantitativ proton-NMR relaterer det integrerede signal af en tildelt resonans til antallet af bidragende kerner og en kvantitativ reference. For et internt referenceeksperiment kan mængdeforholdet udtrykkes som:

n _x = n _r × ( I _x / N _x ) / ( I _r / N _r )

Nedskrivningerne x og r angiver analyt og reference. I er det integrerede signal og N antallet af protoner repræsenteret af dette signal; n _r er den tildelte referencemængde. Udtrykket forudsætter kvantitativt sammenligneligt signalrespons og korrekt peak-tildeling. Konvertering af resultatet til peptidmasse kræver molmassen på det angivne rapporteringsgrundlag.

Li og kolleger sammenlignede qNMR, aminosyreanalyse og kalibreret HPLC i en kollaborativ undersøgelse af et peptidreferencemateriale. Arbejdet demonstrerede den praktiske brug af qNMR og viste også, at metodesammenligninger afhænger af, hvordan standarder og usikkerheder behandles. Dens resultater etablerer ikke en universel rangordning for alle peptidprøver. [8]

Opløs den valgte analyt og referencesignaler fra urenheder, opløsningsmiddel og hinanden. Etabler passende puls- og afslapningsforhold, signal-til-støj og integrationsgrænser. BIPM-vejledning forklarer, hvorfor afslapning skal vurderes for signalerne i selve blandingen. En reference for kemikalieskift er ikke automatisk en kvantitativ standard. Nært beslægtede urenheder, der deler den integrerede resonans, kan bidrage til den målte mængde, selv når integralet er meget repeterbart. [9]

8 Demonstrer kalibreringsområdet

Forbered kalibreringsniveauer, der dækker den tilsigtede prøverespons, og vurder den valgte responsmodel. Undersøg rester og koncentrationerne beregnet tilbage fra kurven. En høj bestemmelseskoefficient, R², kan ikke i sig selv etablere acceptabel kalibrering, især nær den nedre ende af området. Eurachem anbefaler at evaluere regressionsadfærd og overveje vægtning, hvor responsvariansen ændrer sig med koncentrationen. Vælg modellen ved hjælp af eksperimentelle beviser i stedet for udseendet af en plottet linje. [10]

Brug uafhængigt forberedte kontroller til at vurdere ydeevne inden for området. Etabler den laveste koncentration, ved hvilken den nødvendige præcision og bias kan understøttes; detektion af et signal alene er utilstrækkelig. For prøver, der kræver fortynding, demonstreres, at fortynding bevarer et gyldigt resultat. Registrer acceptkriterierne, før prøvesekvensen evalueres, og behold årsagen til et eventuelt udelukket kalibreringspunkt. Anvend kriterier, der passer til det analytiske mål, uden at importere numeriske grænser fra et ikke-relateret assay.

Adskil håndteringstab fra matrixeffekter

Evaluer opløsning, overførsler og holdeperioder ved de koncentrationer, der anvendes til måling. Goebel-Stengel og kolleger viste, at peptidgenvinding kan afhænge af den kontaktede overflade. Uafhængige prøvepræparater hjælper med at afsløre dette bidrag, hvorimod gentagne instrumentmålinger fra det samme hætteglas ikke kan reproducere et tidligere præparattab. Sammenlign passende friske og holdte alikvoter og undersøg genvinding efter enhver filtrering eller oprydning. [11]

For LC–MS kan en ændring i respons afspejle en ændring i ionisering forårsaget af coeluerende prøvebestanddele. Matuszewski og kolleger beskrev eksperimenter, der skelner matrixeffekter fra ekstraktionsgenvinding. Anvendt på en peptidmetode kan sammenligninger mellem pæne standarder, blindekstrakter beriget efter ekstraktion og prøver beriget før ekstraktion hjælpe med at adskille disse påvirkninger, forudsat at koncentrationer, volumener og endogene bidrag håndteres konsekvent. Evaluer den intern-standard-normaliserede respons samt de individuelle signaler. [12]

Medtag tomme felter, der besvarer specifikke spørgsmål. Et reagensblindprøve undersøger indført baggrund; en blindprøve efter en koncentreret prøve undersøger overførsel. Hvor en ægte tom prøvematrix ikke er tilgængelig, skal du dokumentere det alternative design og dets begrænsninger. Et spidsforsøg vurderer genvindingen af ​​tilsat materiale under de testede forhold; det beviser ikke, at en oprindeligt tilstedeværende analyt var fuldstændig genvundet eller fri for interferens.

Rapporter resultatet med dets usikkerhed og omfang

Usikkerhedsvurderingen bør følge målemodellen og omfatte de indflydelsesrige bidrag. Disse kan opstå fra kalibratorværditildeling, vejning og fortynding, præparatgenvinding, kalibrering og repeterbarhed. Redegør for delte input og sammenhænge, ​​hvor det er relevant. JCGM Guide to the Expression of Uncertainty in Measurement giver rammerne for at kombinere sådanne oplysninger og rapportere resultatet. En lille standardafvigelse fra gentagne målinger beskriver kun variationen repræsenteret af disse målinger. [13]

Rapportér prøve- og batchidentifikatorer, definerede peptidarter, målt mængde, enhed, metodeversion og kalibreringsgrundlag. Angiv antallet og typen af ​​uafhængige præparater, og hvordan enhver fortynding eller genvindingskorrektion blev anvendt. Hvis der rapporteres om udvidet usikkerhed, identificeres dækningsfaktoren og den fortolkning, der er begrundet i evalueringen. Bevar de underliggende kromatogrammer eller spektre, integrationsbeslutninger og kontrolresultater.

Når metoderne er uenige, skal du først sammenligne deres kemiske selektivitet og rapporteringsgrundlag. Et hydrolysat-baseret estimat, et opløst intakt-peptid-assay og en pulvermasse kan referere til forskellige mængder. Løs denne forskel, før du tilskriver uenighed instrumentets ydeevne. Det nyttige resultat er en mængde knyttet til en defineret prøve og understøttet af en sporbar eksperimentel registrering.

Forskningsomfang. Denne artikel omhandler analytisk kvantificering af peptidmaterialer i laboratorieprøver. Den giver ingen instruktioner til human eller veterinær brug og gør ingen påstande om biologisk effekt, klinisk egnethed eller regulatorisk godkendelse. Hver måleprocedure kræver vurdering for det tilsigtede prøve- og laboratoriemål.

Referencer

[1] Wang X, Zhang F, Li H, et al. Renhedsbestemmelse af syntetisk glukagon ved hjælp af en massebalancetilgang. Videnskabelige rapporter. 2020;10:4423. doi: 10.1038/s41598-020-61109-9

[2] Bunk DM, Lowenthal MS. Isotopfortynding væskekromatografi-tandem massespektrometri til kvantitativ aminosyreanalyse. I: Amino Acid Analysis: Methods and Protocols. 2. udg. Metoder i molekylærbiologi. 2019;2030. Kapitel 12. doi: 10.1007/978-1-4939-9639-1_12

[3] Muñoz A, Kral R, Schimmel H. Kvantificering af proteinkalibranter ved aminosyreanalyse ved hjælp af isotopfortyndingsmassespektrometri. Analytisk biokemi. 2011;408(1):124-131. doi: 10.1016/j.ab.2010.08.037

[4] Nationalt Center for Bioteknologisk Information. PubChem Compound Summary for CID 750, Glycin. Tilgået 2. november 2026. Kildedokument

[5] Anthis NJ, Clore GM. Sekvensspecifik bestemmelse af protein- og peptidkoncentrationer ved absorbans ved 205 nm. Protein Videnskab. 2013;22(6):851-858. doi: 10.1002/pro.2253

[6] Kuipers BJH, Gruppen H. Forudsigelse af molære ekstinktionskoefficienter for proteiner og peptider ved hjælp af UV-absorption af de indgående aminosyrer ved 214 nm for at muliggøre kvantitativ omvendt fase højtydende væskekromatografi-massespektrometrianalyse. Tidsskrift for landbrugs- og fødevarekemi. 2007;55(14):5445-5451. doi: 10.1021/jf070337l

[7] Stoyanov AV, Rogatsky E, Stein D, et al. Isotopfortyndingsassay i peptidkvantificering: Udfordringen med mikroheterogenitet af intern standard. Proteomics kliniske applikationer. 2013;7(11-12):825-828. doi: 10.1002/prca.201200130

[8] Li C, Bhavaraju S, Melanson JE, et al. Kortlægning af peptidkvantificeringsmetoder og sammenligning af deres reproducerbarhed: Et casestudie med oxytocin. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2019;166:105-112. doi: 10.1016/j.jpba.2018.12.028

[9] Westwood S, Stoppacher N, Martos G, et al. Interne standardreferencedata for qNMR: 3,5-bis(trifluormethyl)benzoesyre. Rapport BIPM-2019/02, ISRD-05. Version 1.0; 13. marts 2019. § 3. Kildedokument

[10] Cantwell H, red. Analytiske metoders egnethed til formål: En laboratorievejledning til metodevalidering og relaterede emner. 3. udg. Eurachem; 2025. Afsnit 5.2-5.4. Kildedokument

[11] Goebel-Stengel M, Stengel A, Taché Y, Reeve JR Jr. Vigtigheden af ​​at bruge det optimale plastik og glasvarer i undersøgelser, der involverer peptider. Analytisk biokemi. 2011;414(1):38–46. doi: 10.1016/j.ab.2011.02.009

[12] Matuszewski BK, Constanzer ML, Chavez-Eng CM. Strategier til vurdering af matrixeffekt i kvantitative bioanalytiske metoder baseret på HPLC-MS/MS. Analytisk kemi. 2003;75(13):3019-3030. doi: 10.1021/ac020361s

[13] Fælles udvalg for vejledere i metrologi. Evaluering af måledata: Vejledning til udtryk for usikkerhed i måling. JCGM 100:2008. Rettet version 2010. Afsnit 4-7. Kildedokument

ALLE ARTIKLER OG PRODUKTINFORMATION LEVERET PÅ DENNE WEBSTED ER KUN TIL INFORMATIONSPREDNING OG UDDANNELSESFORMÅL.

Produkterne på denne hjemmeside er udelukkende beregnet til in vitro-forskning. In vitro-forskning (latin: *i glas*, hvilket betyder i glasvarer) udføres uden for den menneskelige krop. Disse produkter er ikke lægemidler, er ikke blevet godkendt af US Food and Drug Administration (FDA) og må ikke bruges til at forebygge, behandle eller helbrede nogen medicinsk tilstand, sygdom eller lidelse. Det er strengt forbudt ved lov at indføre disse produkter i menneskers eller dyrs krop i nogen form.