Од Cocer Peptides          пред 26 дена.

Апстракт

За квантитативен резултат на пептид потребен е дефиниран хемиски вид, соодветна основа за калибрација и доказ дека ракувањето со примерокот ја зачувува количината што се мери. Масата во прав, процентот на хроматографска површина и целната концентрација на пептид опишуваат различни својства. Третманот со нив како заменливи може да доведе до грешка пред да се направи првото мерење. Оваа статија ја испитува анализата на аминокиселините, апсорпцијата на ултравиолетовите, калибрирана течна хроматографија, масената спектрометрија на разредување на изотоп и квантитативната нуклеарна магнетна резонанца како пристапи кон квантификацијата на пептидите. Ги објаснува информациите што ги обезбедува секој метод, претпоставките потребни за претворање на неговиот сигнал во количина и контролите потребни за толкувачки резултат. Дискусијата се однесува на лабораториски материјали и аналитички решенија. Обезбедува рамка за избор и оценување на мерна постапка, без да се пропишуваат универзални работни услови или ограничувања за прифаќање.

Дефинирајте ја количината што треба да се мери

Пред да изберете инструмент, наведете ја мерката, што значи количеството наменето да се мери. Примерите ја вклучуваат количината на недопрен пептид во одреден дел, неговата масовна концентрација во подготвен раствор или неговата масена фракција во цврст примерок како што е примен. Идентификувајте ја низата, терминалните групи и релевантните модификации. Наведете дали пријавената маса вклучува контрајони или го опишува само делот на пептидот. За резултатот, исто така, потребна е дефинирана граница на примерокот: растворениот дел, целиот препарат или материјал обновен по одредена операција.

Измерената цврста материја може да содржи вода, контра јони, резидуални растворувачи и други компоненти. Голем целен врв во ултравиолетовиот хроматограм не ги мери сите овие состојки. Ванг и колегите демонстрираа пристап за рамнотежа на масата што комбинираше мерења на неколку класи на нечистотии за да карактеризира синтетички пептиден материјал. Ова илустрира зошто процентот на хроматографска површина не може автоматски да се замени со масениот удел на пептид кога се подготвува квантитативен стандард. [1]

Воспоставете ја основата за калибрација

На калибраторот му е потребна доделена количина соодветна на мерењето, заедно со неговата несигурност и условите под кои се применува тоа доделување. Проверете го сертификатот за точниот дел, хемиската форма, основата на вредноста и упатствата за ракување. Етикетата која наведува хроматографска чистота сама по себе не обезбедува целна концентрација. Bunk и Lowenthal ја опишуваат употребата на анализа на аминокиселини со разредување на изотоп во NIST за поддршка на концентрациите за референтни материјали за пептиди и протеини. Таквото доделување бара документирана процедура за мерење, наместо номинална тежина на прав. [2]

За раствор подготвен квантитативно од материјал со утврдена целна масена фракција, масената концентрација е:

ρ = m × w / V

Овде, m е масата на измерениот материјал, w е неговата целна масена фракција на пептид на истата основа, а V е конечниот волумен на растворот. Ако m е во милиграми, w во милиграми на милиграм и V во милилитри, ρ е во милиграми на милилитар. Пресметката претпоставува целосно распаѓање и пренос. Не ги потврдува тие операции. За конверзија во концентрација на количество потребна е моларната маса на експлицитно дефинираниот хемиски вид.

Подгответе независно решение за проверка кога е изводливо. Стандардите за калибрација и проверките добиени од една неправилно доделена залиха може да се совпаѓаат едни со други додека ја носат истата грешка. Зачувајте ги записите за подготовка и разредување на залихите за да може да се реконструира изворот на секоја доделена концентрација.

Изберете метод со соодветна хемиска селективност

Изберете го методот според составот на примерокот, очекуваната концентрација и несигурноста потребни за експериментот. Релативно чист референтен материјал и мешавина која содржи неколку поврзани пептиди претставуваат различни проблеми со мерењето. Табелата 1 ги споредува главните опции дискутирани подолу. Ограничувачкото прашање е дали измерениот одговор може да се припише на дефинираната цел со доволна доверба.

Табела 1 Опции за мерење и нивните главни ограничувања

Поврзете ги мерењата на аминокиселините со количината на пептиди

Анализата на аминокиселините прво го претвора пептидот во мерливи составни амино киселини. За остаток што се појавува ν _i пати во низата, набљудуваната количина n _i би одговарала на количината на пептид n _i / ν _i ако ослободувањето е целосно и ниеден друг извор не придонесува за таа амино киселина. Споредете ги проценките од неколку соодветни остатоци каде што дозволува редоследот. Несогласувањето може да открие проблем што инаку би го сокрил просечниот.

Хидролизата мора да ги ослободи избраните остатоци без неприфатливо губење или конверзија на измерените амино киселини. Бунк и Ловентал нагласуваат дека овие услови бараат валидација за секој аналит. Муњоз и неговите колеги процениле неколку аминокиселини при квантифицирање на протеинските калибранти со разредување на изотоп, обезбедувајќи експериментален пример за користење на договор меѓу проценките засновани на остатоци за да се процени хидролизата. Условите воспоставени за еден материјал не треба да се сметаат за соодветни за различен пептид. [2,3]

Слободните амино киселини и други пептиди можат да придонесат за хидролизатот. Следствено, само анализата на аминокиселините може да ја утврди вкупната содржина поврзана со составот без селективно квантифицирање на наменетата недопрена секвенца. Вклучете соодветни празни места за хидролиза и истражете ги овие придонеси пред да назначите целна вредност. Користете го хемискиот идентитет и формата на слободната аминокиселина при пресметување на количините на калибраторот. На пример, PubChem го идентификува глицинот како CID 750; записот на базата на податоци поддржува проверка на идентитетот, но не ја потврдува содржината на референтниот материјал за аминокиселини. [4]

Толкувајте ги ултравиолетовите мерења преку низата

За хомоген раствор во соодветен инструментален опсег, врската Beer-Lambert A = εlc ја поврзува празно коригирана апсорпција A со моларна апсорпција ε, должина на оптичката патека l и концентрација на количина c. Апсорптивноста мора да одговара на условите за пептид, бранова должина и мерење. Апсорпцијата близу 280 nm зависи силно од ароматичните остатоци и не може да послужи како општо мерење на концентрацијата за секој пептид. Антис и Клор развија пристап базиран на секвенца на 205 nm, покажувајќи ја вредноста на сметководството за составот наместо примена на единствен фактор на конверзија. [5]

При пократки бранови должини, апсорпцијата на растворувачи и пуфер може да стане ограничувачка. Користете празно место кое одговара на составот, проверете го употребливиот оптички опсег и споредете ги соодветните разредувања. Заматеноста или апсорпционата нечистотија може да предизвика очигледна промена на концентрацијата која не е поврзана со целта. Затоа, резултатот од директна апсорпција треба да ги носи претпоставките за составот на примерокот од кој зависи.

Хроматографското раздвојување може да ја подобри селективноста пред мерењето на УВ, но квантитативната LC анализа сè уште бара соодветна врска со одговорот. Куиперс и Групен измериле различни придонеси на амино киселините и пептидните врски во апсорпцијата на 214 nm. Нивните наоди објаснуваат зошто еднаквите врвни површини од различни пептиди не треба да претставуваат еднакви количини. За квантификација на целта, споредете го решениот одговор на целта со соодветните доделени стандарди и потврдете ја калибрацијата под вистинските аналитички услови. [6]

Проценете го внатрешниот стандард за разредување на изотоп LC–MS

При разредување на изотоп LC-MS, одговорот на целта се споредува со оној на додаден изотопски означен колега преку дефиниран модел на калибрација. Потврдете го идентитетот, доделената количина и изотопскиот состав на тој стандард. Испитајте ја хроматографската кореспонденција, релевантните јонски канали и можниот придонес на неозначен материјал во целниот канал. Стојанов и неговите колеги илустрираа како неоткриената хетерогеност во внатрешните стандарди на пептидите може да ја наруши добиената целна концентрација. Самото означување не воспоставува сигурна квантитативна референца. [7]

Додадете го внатрешниот стандард во фаза соодветна на загубите што треба да ги следи и утврдете дека се однесува доволно како аналитот. Стандардот воведен по екстракција не може да ги коригира загубите што настанале за време на тоа екстракција. Дури и раното додавање бара соодветно мешање и споредливо однесување. Задржете ги и апсолутните одговори и нивниот сооднос: стабилен сооднос може да прикрие големи промени во чувствителноста или ракувањето со примерокот што заслужуваат истрага.

Изберете транзиции или сигнали со извлечени јони кои се покажано соодветни за целта во матрицата на примерокот. Соодветната вредност на маса до полнење, сама по себе, не е доказ дека компонентата што пречи е отсутна. Непроменетиот резултат на пептид, исто така, не треба да се конвертира во родителска концентрација на протеин без одделно да се воспостават односите за варење и обновување.

Користете квантитативна NMR со доделени сигнали и референци

Квантитативниот протонски NMR го поврзува интегрираниот сигнал на доделената резонанца со бројот на јадра кои придонесуваат и квантитативната референца. За експеримент со внатрешна референца, односот на износот може да се изрази како:

n _x = n _r × ( I _x / N _x ) / ( I _r / N _r )

Претставките x и r означуваат аналит и референца. I е интегрираниот сигнал и N бројот на протони претставени со тој сигнал; n _r е доделениот износ на референца. Изразот претпоставува квантитативно споредлив одговор на сигналот и правилно доделување на врвот. Конвертирањето на резултатот во пептидна маса бара моларна маса на наведената основа за известување.

Ли и колегите ги споредија qNMR, анализата на аминокиселините и калибрираниот HPLC во заедничка студија на референтен материјал од пептид. Работата ја покажа практичната употреба на qNMR и исто така покажа дека споредбите на методи зависат од тоа како се третираат стандардите и несигурноста. Неговите наоди не воспоставуваат универзално рангирање за сите примероци на пептиди. [8]

Разрешете го избраниот аналит и референтните сигнали од нечистотии, растворувач и едни од други. Воспоставете соодветни услови за пулсот и релаксација, границите на сигнал до бучава и интеграција. Упатството за BIPM објаснува зошто релаксацијата мора да се процени за сигналите во вистинската мешавина. Референцата за хемиска промена не е автоматски квантитативен стандард. Тесно поврзаните нечистотии кои ја делат интегрираната резонанца може да придонесат за измерената количина дури и кога интегралот е многу повторлив. [9]

8 Покажете го опсегот на калибрација

Подгответе ги нивоата на калибрација кои го покриваат планираниот одговор на примерокот и проценете го избраниот модел на одговор. Испитајте ги остатоците и концентрациите пресметани назад од кривата. Високиот коефициент на определување, R², сам по себе не може да воспостави прифатлива калибрација, особено во близина на долниот крај на опсегот. Eurachem препорачува да се оцени регресивното однесување и да се земе предвид пондерирањето каде варијансата на одговорот се менува со концентрацијата. Изберете го моделот користејќи експериментални докази наместо изгледот на исцртана линија. [10]

Користете независно подготвени контроли за да ги оцените перформансите во опсегот. Воспоставете најниска концентрација во која може да се поддржи потребната прецизност и пристрасност; самото откривање на сигнал е недоволно. За примероците за кои е потребно разредување, докажете дека разредувањето го зачувува валиден резултат. Запишете ги критериумите за прифаќање пред да ја оцените низата на примерокот и задржете ја причината за која било исклучена точка на калибрација. Применете ги критериумите прилагодени на аналитичката цел, без да внесувате нумерички ограничувања од неповрзана анализа.

Одделете ги загубите при ракување од ефектите на матрицата

Оценете ги периодите на растворање, трансфери и задржување во концентрациите што се користат за мерење. Гебел-Стенгел и неговите колеги покажаа дека обновувањето на пептидите може да зависи од контактната површина. Независните препарати за примероци помагаат да се открие овој придонес, додека повторените мерења со инструменти од истата вијала не можат да репродуцираат претходна загуба на подготовка. Споредете ги соодветните свежи и задржани количества и истражете го обновувањето по каква било филтрација или чистење. [11]

За LC-MS, промената во одговорот може да ја одрази промената во јонизацијата предизвикана од коелутирачките состојки на примерокот. Matuszewski и неговите колеги опишаа експерименти кои ги разликуваат ефектите на матрицата од обновувањето на екстракција. Применети на пептиден метод, споредбите меѓу уредните стандарди, празни екстракти збогатени по екстракција и примероци збогатени пред екстракција може да помогнат да се разделат овие влијанија, под услов концентрациите, волумените и ендогените придонеси да се постапуваат доследно. Оценете го интерно-стандардно нормализираниот одговор, како и поединечните сигнали. [12]

Вклучете празни места што одговараат на конкретни прашања. Празен реагенс ја испитува воведената позадина; празно откако концентриран примерок го испитува преносот. Онаму каде што не е достапна навистина празна матрица за примероци, документирајте го алтернативниот дизајн и неговите ограничувања. Експеримент со шила го проценува обновувањето на додадениот материјал во тестираните услови; не докажува дека првично присутниот аналит бил целосно обновен или ослободен од пречки.

Пријавете го резултатот со неговата несигурност и опсег

Проценката на несигурноста треба да го следи моделот на мерење и да ги вклучи влијателните придонеси. Тие можат да произлезат од доделување на вредноста на калибраторот, мерење и разредување, враќање на подготовката, калибрација и повторливост. Сметајте ги споделените влезови и корелации каде што е релевантно. JCGM Водичот за изразување на несигурност во мерењето ја дава рамката за комбинирање на таквите информации и известување за резултатот. Мало стандардно отстапување од повторените мерења ја опишува само варијацијата претставена со тие мерења. [13]

Пријавете ги идентификаторите на примерокот и сериите, дефинираните видови пептиди, измерената количина, единицата, верзијата на методот и основата за калибрација. Наведете го бројот и видот на независните препарати и како е применета каква било корекција на разредување или обновување. Доколку се пријави проширена несигурност, идентификувајте го факторот на покриеност и толкувањето оправдано со евалуацијата. Зачувајте ги основните хроматограми или спектри, одлуките за интеграција и резултатите од контролата.

Кога методите не се согласуваат, прво споредете ја нивната хемиска селективност и основите на известување. Проценка заснована на хидролиза, решен тест на непроменети пептиди и маса во прав може да се однесуваат на различни количини. Решете ја таа разлика пред да припишете несогласување на перформансите на инструментот. Корисниот резултат е количина поврзана со дефиниран примерок и поддржана од експериментален запис што може да се следи.

Обем на истражување. Оваа статија се однесува на аналитичката квантификација на пептидните материјали во лабораториските примероци. Не дава упатства за човечка или ветеринарна употреба и не тврди за биолошката ефикасност, клиничката соодветност или регулаторно одобрение. Секоја постапка на мерење бара проценка за предвидената мостра и лабораториската цел.

Референци

[1] Ванг Икс, Џанг Ф, Ли Х и др. Определување на чистота на синтетички глукагон користејќи пристап на рамнотежа на масата. Научни извештаи. 2020; 10:4423. doi: 10.1038/s41598-020-61109-9

[2] Банк ДМ, Ловентал МС. Течна хроматографија со разредување на изотоп-тандем масена спектрометрија за квантитативна анализа на аминокиселини. Во: Анализа на амино киселини: методи и протоколи. 2. ед. Методи во молекуларната биологија. 2019; 2030 година. Поглавје 12. doi: 10.1007/978-1-4939-9639-1_12

[3] Muñoz A, Kral R, Schimmel H. Квантификација на протеински калибранти со анализа на аминокиселини користејќи масена спектрометрија за разредување на изотоп. Аналитичка биохемија. 2011; 408 (1): 124-131. doi: 10.1016/j.ab.2010.08.037

[4] Национален центар за биотехнолошки информации. Резиме на соединение PubChem за CID 750, глицин. Пристапено на 2 ноември 2026 година. Изворниот документ

[5] Антис Њу Џеј, Клор Г.М. Специфично за секвенца определување на концентрациите на протеини и пептиди со апсорпција на 205 nm. Протеинска наука. 2013; 22 (6): 851-858. doi: 10.1002/pro.2253

[6] Kuipers BJH, Gruppen H. Предвидување на коефициентите на моларно изумирање на протеините и пептидите користејќи UV апсорпција на составните амино киселини на 214 nm за да се овозможи квантитативна анализа на течна хроматографија-масена спектрометрија со високи перформанси во обратна фаза. Весник за земјоделска и прехранбена хемија. 2007; 55 (14): 5445-5451. doi: 10.1021/jf070337l

[7] Стојанов А.В., Рогатски Е, Штајн Д и др. Тест за разредување на изотоп во квантификација на пептиди: Предизвикот на микрохетерогеноста на внатрешниот стандард. Клинички апликации Proteomics. 2013; 7 (11-12): 825-828. doi: 10.1002/prca.201200130

[8] Ли Ц, Бхавараџу С, Мелансон ЈЕ, и сор. Истражување на методите за квантификација на пептиди и споредба на нивната репродуктивност: Студија на случај користејќи окситоцин. Весник за фармацевтска и биомедицинска анализа. 2019; 166: 105-112. doi: 10.1016/j.jpba.2018.12.028

[9] Вествуд С, Стопачер Н, Мартос Г, и сор. Внатрешни стандардни референтни податоци за qNMR: 3,5-Бис(трифлуорометил)бензоева киселина. Известување BIPM-2019/02, ISRD-05. Верзија 1.0; 13 март 2019. Дел 3. Изворниот документ

[10] Кантвел Х, ед. Фитнес за цел на аналитичките методи: Лабораториски водич за валидација на методи и сродни теми. 3-ти ед. Еврахем; 2025. Делови 5.2–5.4. Изворниот документ

[11] Goebel-Stengel M, Stengel A, Taché Y, Reeve JR Jr. Важноста на користењето на оптималниот пластичен и стаклен прибор во студиите кои вклучуваат пептиди. Аналитичка биохемија. 2011; 414 (1): 38-46. doi: 10.1016/j.ab.2011.02.009

[12] Matuszewski BK, Constanzer ML, Chavez-Eng CM. Стратегии за проценка на ефектот на матрицата во квантитативни биоаналитички методи базирани на HPLC-MS/MS. Аналитичка хемија. 2003; 75 (13): 3019-3030. doi: 10.1021/ac020361s

[13] Заеднички комитет за водичи во метрологијата. Евалуација на податоците од мерењето: Водич за изразување на несигурност во мерењето. JCGM 100:2008. Поправена верзија 2010. Делови 4–7. Изворниот документ

СИТЕ СТАТИИ И ИНФОРМАЦИИ ЗА ПРОИЗВОДОТ ОБЕЗБЕНИ НА ОВАА ВЕБ СТРАНИЦА СЕ САМО ЗА ДИСЕМИНАЦИЈА НА ИНФОРМАЦИИ И ЕДУКАЦИСКИ ЦЕЛИ.

Производите дадени на оваа веб-локација се наменети исклучиво за ин витро истражување. Истражувањето ин витро (латински: *во стакло*, што значи во стаклени садови) се спроведува надвор од човечкото тело. Овие производи не се фармацевтски производи, не се одобрени од Управата за храна и лекови на САД (FDA) и не смеат да се користат за спречување, лекување или лекување на каква било медицинска состојба, болест или болест. Со закон е строго забрането да се внесуваат овие производи во телото на човекот или животните во која било форма.