Eftir Cocer Peptides          fyrir 26 dögum.

Ágrip

Magnbundin peptíðniðurstaða krefst skilgreindrar efnategundar, viðeigandi kvörðunargrunns og sönnunar fyrir því að meðhöndlun sýnis varðveiti magnið sem verið er að mæla. Duftmassi, litskiljunarsvæðishlutfall og markpeptíðstyrkur lýsa mismunandi eiginleikum. Með því að meðhöndla þær sem skiptanlegar getur komið fram villa áður en fyrsta mælingin er gerð. Þessi grein skoðar amínósýrugreiningu, útfjólubláa gleypni, kvarðaða vökvaskiljun, samsætuþynningarmassagreiningu og megindlega kjarnasegulómun sem aðferðir við magngreiningu peptíðs. Það útskýrir upplýsingarnar sem hver aðferð gefur, forsendurnar sem þarf til að umbreyta merki þess í magn og eftirlitið sem þarf til að túlka niðurstöðu. Umræðan snýst um rannsóknarstofuefni og greiningarlausnir. Það veitir ramma fyrir val og mat á mælingarferli, án þess að mæla fyrir um alhliða rekstrarskilyrði eða viðurkenningarmörk.

Skilgreindu magnið sem á að mæla

Tilgreindu mælinguna, sem þýðir magnið sem á að mæla, áður en þú velur tæki. Sem dæmi má nefna magn ósnorts peptíðs í deilskammti, massastyrkur þess í tilbúinni lausn eða massahlutfall þess í föstu sýni eins og það hefur borist. Þekkja röðina, endahópa og viðeigandi breytingar. Tilgreinið hvort massinn sem greint er frá inniheldur mótjónir eða lýsi peptíðhlutanum einum saman. Niðurstaðan þarf einnig skilgreind sýnismörk: uppleysta hlutinn, allan undirbúninginn eða efnið sem er endurheimt eftir tiltekna aðgerð.

Vegið fast efni getur innihaldið vatn, mótjónir, leifar af leysiefnum og öðrum íhlutum. Stór marktoppur í útfjólubláu litskiljun mælir ekki öll þessi efni. Wang og félagar sýndu massajafnvægisaðferð sem sameinaði mælingar á nokkrum óhreinindaflokkum til að einkenna tilbúið peptíð efni. Þetta sýnir hvers vegna ekki er sjálfkrafa hægt að koma í stað peptíðmassahlutfalls í stað litskiljunarsvæðis þegar magnstaðall er útbúinn. [1]

Komdu á kvörðunargrundvelli

Kvörðunartæki þarf úthlutað magn sem hæfir mælingunni, ásamt óvissu þess og þeim skilyrðum sem sú úthlutun á við. Athugaðu vottorðið fyrir nákvæma lotu, efnaform, gildisgrundvöll og meðhöndlunarleiðbeiningar. Merki sem tilgreinir hreinleika litskiljunar einn og sér gefur ekki markstyrk. Bunk og Lowenthal lýsa notkun samsætuþynningar amínósýrugreiningar við NIST til að styðja við styrkveitingar fyrir peptíð og próteinviðmiðunarefni. Slík úthlutun krefst skjalfestrar mælingar, frekar en nafnduftþyngdar. [2]

Fyrir lausn sem er unnin magnbundið úr efni með staðfestan markmassahlutfall er massastyrkurinn:

ρ = m × w/V

Hér er m massi efnisins sem er vigtaður, w er markpeptíðmassahlutfall þess á sama grunni og V er lokarúmmál lausnarinnar. Ef m er í milligrömmum, w í milligrömmum á milligrömm og V í millilítrum, er ρ í milligrömmum á millilítra. Í útreikningnum er gert ráð fyrir algjörri upplausn og flutningi. Það sannreynir ekki þessar aðgerðir. Umbreyting í magnstyrk krefst mólmassa af skýrt skilgreindum efnategundum.

Undirbúa óháða eftirlitslausn þegar mögulegt er. Kvörðunarstaðlar og athuganir sem fengnar eru úr einum ranglega úthlutað lager geta verið sammála hvor öðrum á meðan þeir bera sömu villu. Geymdu stofnundirbúnings- og þynningarskrár þannig að hægt sé að endurgera uppruna hvers úthlutaðs styrks.

Veldu aðferð með fullnægjandi efnavalhæfi

Veldu aðferð í samræmi við sýnissamsetningu, væntan styrk og óvissu sem þarf fyrir tilraunina. Tiltölulega hreint viðmiðunarefni og blanda sem inniheldur nokkur skyld peptíð hafa mismunandi mælivandamál. Tafla 1 ber saman helstu valkostina sem fjallað er um hér að neðan. Takmarkandi spurningin er hvort hægt sé að rekja mælda svörun til skilgreinds markmiðs með nægilegu öryggi.

Tafla 1 Mælingarmöguleikar og helstu takmarkanir þeirra

Tengja amínósýrumælingar við magn peptíðs

Amínósýrugreining breytir fyrst peptíði í mælanlegar amínósýrur. Fyrir leif sem kemur fyrir ν _i sinnum í röðinni, myndi athugað magn n _i samsvara peptíðmagni n _i / ν _i ef losun væri fullkomin og engin önnur uppspretta stuðlaði að þeirri amínósýru. Berðu saman mat úr nokkrum hentugum leifum þar sem röðin leyfir. Ágreiningur getur leitt í ljós vandamál sem meðaltal myndi annars leyna.

Vatnsrof verður að losa valda leifar án óviðunandi taps eða umbreytingar á mældum amínósýrum. Bunk og Lowenthal leggja áherslu á að þessar aðstæður krefjist löggildingar fyrir hvert greiniefni. Muñoz og félagar mátu nokkrar amínósýrur við magn próteinkvörðunar með samsætuþynningu, sem gaf tilraunadæmi um að nota samkomulag á milli leifaratengdra mata til að meta vatnsrof. Ekki ætti að gera ráð fyrir að skilyrðin sem sett eru fyrir eitt efni séu fullnægjandi fyrir annað peptíð. [2,3]

Frjálsar amínósýrur og önnur peptíð geta stuðlað að vatnsrofinu. Þar af leiðandi getur amínósýrugreining ein og sér komið á heildarsamsetningu sem tengist innihaldi án þess að mæla fyrirhugaða ósnortna röð með vali. Láttu viðeigandi vatnsrofseyðir fylgja með og athugaðu þessi framlög áður en markgildi er úthlutað. Notaðu efnafræðilega auðkenni og form fríu amínósýrunnar þegar þú reiknar út magn kvörðunartækis. Til dæmis auðkennir PubChem glýsín sem CID 750; gagnagrunnsskráin styður auðkennisskoðun en vottar ekki innihald amínósýruviðmiðunarefnis. [4]

Túlka útfjólubláar mælingar í gegnum röðina

Fyrir einsleita lausn innan viðeigandi tækjasviðs, tengir Beer-Lambert sambandið A = εlc eyðuleiðrétt gleypni A við mólgleypni ε, ljósleiðarlengd l og magnstyrk c. Frásogsgetan verður að samsvara peptíðinu, bylgjulengdinni og mæliskilyrðunum. Frásog nálægt 280 nm veltur mjög á arómatískum leifum og getur ekki þjónað sem almenn styrksmæling fyrir hvert peptíð. Anthis og Clore þróuðu röð byggða nálgun við 205 nm, sem sýnir gildi þess að gera grein fyrir samsetningu frekar en að beita einum umbreytingarstuðli. [5]

Við styttri bylgjulengdir getur frásog leysis og stuðpúða orðið takmarkandi. Notaðu eyðu sem samsvarar samsetningu, athugaðu nothæft sjónsvið og berðu saman viðeigandi þynningar. Gruggur eða gleypandi óhreinindi geta valdið augljósri styrkbreytingu sem er ótengd markinu. Niðurstaða bein gleypni ætti því að hafa þær forsendur um samsetningu sýnis sem hún er háð.

Litskiljun getur bætt sértækni fyrir UV mælingu, en megindleg LC próf krefst samt viðeigandi svörunarsambands. Kuipers og Gruppen mældu mismunandi framlag amínósýra og peptíðtengja til gleypni við 214 nm. Niðurstöður þeirra útskýra hvers vegna jöfn toppsvæði frá mismunandi peptíðum þurfa ekki að tákna jafnt magn. Til að ákvarða markmagn, berðu saman uppleysta marksvörun við viðeigandi úthlutaða staðla og staðfestu kvörðunina við raunverulegar greiningaraðstæður. [6]

Metið innri staðalinn í samsætuþynningu LC–MS

Í samsætuþynningu LC–MS er svörun marksins borin saman við svörun viðbætts samsætumerkta hliðstæðu með skilgreindu kvörðunarlíkani. Staðfestu auðkenni, úthlutað magn og samsætusamsetningu þess staðals. Skoðaðu litskiljunarsamsvörun, viðeigandi jónagöng og hugsanlegt framlag ómerkts efnis til markrásarinnar. Stoyanov og félagar sýndu hvernig óútskýrð misleitni í innri stöðlum peptíðs getur skaðað markstyrkinn sem myndast. Merking ein og sér skapar ekki áreiðanlega megindlega tilvísun. [7]

Bættu innri staðlinum við á viðeigandi stigi fyrir tapið sem honum er ætlað að rekja og staðfestu að hann hegði sér nægilega eins og greiniefnið. Staðall sem kynntur er eftir útdrátt getur ekki leiðrétt tap sem varð við þá útdrátt. Jafnvel snemmbúin viðbót krefst fullnægjandi blöndunar og sambærilegrar hegðunar. Haltu bæði algildum svörum og hlutfalli þeirra: stöðugt hlutfall getur leynt stórum breytingum á næmi eða meðhöndlun sýna sem verðskulda rannsókn.

Veldu umbreytingar eða útdregin jónamerki sem eru sannanlega hentug fyrir markið í sýnisfylki. Samsvörun massa-til-hleðslu gildi er ekki í sjálfu sér sönnun þess að truflandi hluti sé ekki til. Ósnortinn peptíðniðurstaða ætti heldur ekki að breyta í styrkleika móðurpróteins án þess að koma sérstaklega á tengsl meltingar og bata.

Notaðu megindlega NMR með úthlutuðum merkjum og tilvísunum

Megindleg róteinda NMR tengir samþætt merki um úthlutað ómun við fjölda kjarna sem stuðla að og megindlega tilvísun. Fyrir innri viðmiðunartilraun er hægt að gefa upp magnsambandið sem:

n _x = n _r × ( I _x / N _x ) / ( I _r / N _r )

Undirskriftirnar x og r tákna greiningarefni og tilvísun. I er samþætta merkið og N fjöldi róteinda sem það merki táknar; n _r er úthlutað magn tilvísunar. Tjáningin gerir ráð fyrir megindlega sambærilegri merkjasvörun og réttri hámarksúthlutun. Til að breyta niðurstöðunni í peptíðmassa þarf mólmassann á tilgreindum skýrslugrundvelli.

Li og félagar báru saman qNMR, amínósýrugreiningu og kvarðaða HPLC í samvinnurannsókn á peptíðviðmiðunarefni. Verkið sýndi fram á hagnýta notkun qNMR og sýndi einnig að aðferðasamanburður er háður því hvernig farið er með staðla og óvissu. Niðurstöður þess staðfesta ekki alhliða röðun fyrir öll peptíðsýni. [8]

Leysið valið greiniefni og viðmiðunarmerki úr óhreinindum, leysi og hvert öðru. Komdu á viðeigandi púls- og slökunarskilyrðum, merki til hávaða og samþættingarmörk. BIPM leiðbeiningar útskýra hvers vegna slökun verður að meta fyrir merki í raunverulegu blöndunni. Efnabreytingartilvísun er ekki sjálfkrafa megindlegur staðall. Náskyld óhreinindi sem deila samþættri ómun geta stuðlað að mældu magni, jafnvel þegar heildin er mjög endurtekin. [9]

8 Sýndu kvörðunarsviðið

Undirbúið kvörðunarstig sem ná yfir fyrirhugaða úrtakssvörun og metið valið svarlíkan. Skoðaðu leifar og styrkinn reiknaður til baka frá ferlinum. Hár ákvörðunarstuðull, R², getur ekki ein og sér komið á viðunandi kvörðun, sérstaklega nálægt neðri enda sviðsins. Eurachem mælir með því að meta aðhvarfshegðun og íhuga vigtun þar sem svörunarfrávik breytist með einbeitingu. Veldu líkanið með því að nota tilraunagögn frekar en útlit teiknaðrar línu. [10]

Notaðu sjálfstætt undirbúnar stýringar til að meta frammistöðu innan marka. Komdu á lægsta styrk sem hægt er að styðja við nauðsynlega nákvæmni og hlutdrægni; uppgötvun á merki eitt og sér er ófullnægjandi. Fyrir sýni sem þarfnast þynningar skal sýna fram á að þynning varðveitir gilda niðurstöðu. Skráðu viðurkenningarviðmiðin áður en sýnisröðin er metin og haltu ástæðunni fyrir útilokuðum kvörðunarpunkti. Notaðu viðmiðanir sem henta greiningarmarkmiðinu, án þess að flytja inn töluleg mörk úr óskyldri greiningu.

Aðskilið meðhöndlunartap frá fylkisáhrifum

Metið upplausn, tilfærslur og geymslutíma við þann styrk sem notaður er við mælingar. Goebel-Stengel og félagar sýndu fram á að endurheimt peptíðs getur verið háð yfirborði sem snertir hafa verið. Óháð sýnishorn hjálpar til við að sýna þetta framlag, en endurteknar mælingar á tækjabúnaði úr sama hettuglasinu geta ekki endurskapað fyrra tap á undirbúningi. Berðu saman viðeigandi ferska og geymda skammta og rannsakaðu bata eftir síun eða hreinsun. [11]

Fyrir LC–MS getur breyting á svörun endurspeglað breytingu á jónun sem stafar af samhljóðandi sýnisþáttum. Matuszewski og félagar lýstu tilraunum sem greina fylkisáhrif frá bata útdráttar. Notað á peptíðaðferð getur samanburður á snyrtilegum stöðlum, núllútdrætti styrkt eftir útdrátt og sýni styrkt fyrir útdrátt hjálpað til við að aðskilja þessi áhrif, að því tilskildu að styrkur, rúmmál og innræn framlög séu meðhöndluð stöðugt. Metið innri staðal-normalized svörun sem og einstök merki. [12]

Taktu með eyðurnar sem svara ákveðnum spurningum. A hvarfefni skoðar innleiddan bakgrunn; auða eftir að þétt sýni skoðar flutning. Þar sem raunverulegt autt sýnishorn er ekki tiltækt, skjalfestu aðra hönnun og takmarkanir hennar. Gaddatilraun metur endurheimt viðbætts efnis við prófaðar aðstæður; það sannar ekki að greiniefni sem upphaflega var til staðar hafi verið að fullu endurheimt eða laust við truflanir.

Greindu niðurstöðuna með óvissu og umfangi

Óvissumatið ætti að fylgja mælilíkaninu og innihalda áhrifamikil framlög. Þetta getur stafað af úthlutun kvörðunargilda, vigtun og þynningu, endurheimt undirbúnings, kvörðun og endurtekningarhæfni. Gerðu grein fyrir sameiginlegum aðföngum og fylgni þar sem við á. JCGM leiðarvísir um tjáningu óvissu í mælingu veitir rammann til að sameina slíkar upplýsingar og tilkynna niðurstöðuna. Lítið staðalfrávik frá endurteknum mælingum lýsir aðeins frávikinu sem þessar mælingar tákna. [13]

Tilkynntu sýnis- og lotuauðkenni, skilgreindar peptíðtegundir, mælt magn, einingu, aðferðarútgáfu og kvörðunargrundvöll. Tilgreinið fjölda og gerð óháðra efnablandna og hvernig einhverri þynningu eða endurheimtleiðréttingu var beitt. Ef tilkynnt er um aukna óvissu skal tilgreina þekjuþáttinn og þá túlkun sem matið réttlætir. Varðveittu undirliggjandi litskiljun eða litróf, samþættingarákvarðanir og eftirlitsniðurstöður.

Þegar aðferðir eru ósammála skaltu fyrst bera saman efnaval þeirra og skýrslugrunn. Áætlun sem byggir á vatnsrofi, leyst ósnortið peptíðpróf og duftmassa geta átt við mismunandi magn. Leysið þann mun áður en ágreiningur er rekinn til frammistöðu hljóðfæra. Gagnleg niðurstaða er magn bundið við skilgreint sýni og studd af rekjanlegri tilraunaskrá.

Rannsóknarumfang. Þessi grein fjallar um greinandi magngreiningu á peptíðefnum í rannsóknarsýnum. Það veitir engar leiðbeiningar um notkun manna eða dýra og gerir engar kröfur um líffræðilega verkun, klínískt hæfi eða eftirlitssamþykki. Hvert mælingarferli krefst mats fyrir fyrirhugað sýni og rannsóknarstofumarkmið.

Heimildir

[1] Wang X, Zhang F, Li H, o.fl. Hreinleikaákvörðun tilbúins glúkagons með því að nota massajafnvægisaðferð. Vísindalegar skýrslur. 2020;10:4423. doi: 10.1038/s41598-020-61109-9

[2] Bunk DM, Lowenthal MS. Vökvaskiljun samsætuþynningar-tandem massagreiningar fyrir megindlega amínósýrugreiningu. Í: Amino Acid Analysis: Methods and Protocols. 2. útg. Aðferðir í sameindalíffræði. 2019;2030. 12. kafli. doi: 10.1007/978-1-4939-9639-1_12

[3] Muñoz A, Kral R, Schimmel H. Magngreining á próteinkvörðum með amínósýrugreiningu með því að nota samsætuþynningarmassagreiningu. Greinandi lífefnafræði. 2011;408(1):124–131. Doi: 10.1016/j.ab.2010.08.037

[4] Landsmiðstöð fyrir líftækniupplýsingar. PubChem Compound Samantekt fyrir CID 750, Glycine. Skoðað 2. nóvember 2026. Heimildarskjal

[5] Anthis NJ, Clore GM. Raðarsértæk ákvörðun á styrk próteins og peptíðs með gleypni við 205 nm. Próteinvísindi. 2013;22(6):851–858. doi: 10.1002/pro.2253

[6] Kuipers BJH, Gruppen H. Spá um mólútrýmingarstuðla próteina og peptíða með því að nota útfjólubláa frásog amínósýra sem innihalda innihaldsefnin við 214 nm til að gera magngreinda öfugfasa hágæða vökvaskiljun-massagreiningu greiningu. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2007;55(14):5445–5451. doi: 10.1021/jf070337l

[7] Stoyanov AV, Rogatsky E, Stein D, o.fl. Samsætuþynningarpróf í peptíðmagngreiningu: Áskorunin um öreiginleika innri staðals. Proteomics klínísk forrit. 2013;7(11–12):825–828. doi: 10.1002/prca.201200130

[8] Li C, Bhavaraju S, Melanson JE, o.fl. Könnun á magngreiningaraðferðum peptíðs og samanburður á fjölföldunarhæfni þeirra: Tilviksrannsókn með oxýtósíni. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2019;166:105–112. doi: 10.1016/j.jpba.2018.12.028

[9] Westwood S, Stoppacher N, Martos G, et al. Innri staðalviðmiðunargögn fyrir qNMR: 3,5-bis(tríflúormetýl)bensósýra. Skýrsla BIPM-2019/02, ISRD-05. Útgáfa 1.0; 13. mars 2019. 3. liður. Heimildarskjal

[10] Cantwell H, útg. Hæfni greiningaraðferða til tilgangs: Leiðbeiningar um rannsóknarstofu um sannprófun aðferða og skyld efni. 3. útg. Eurachem; 2025. Kaflar 5.2–5.4. Heimildarskjal

[11] Goebel-Stengel M, Stengel A, Taché Y, Reeve JR Jr. Mikilvægi þess að nota bestu plastvörur og glervörur í rannsóknum sem taka þátt í peptíðum. Greinandi lífefnafræði. 2011;414(1):38–46. Doi: 10.1016/j.ab.2011.02.009

[12] Matuszewski BK, Constanzer ML, Chavez-Eng CM. Aðferðir við mat á áhrifum fylkis í megindlegum lífgreiningaraðferðum byggðar á HPLC-MS/MS. Greinandi efnafræði. 2003;75(13):3019–3030. doi: 10.1021/ac020361s

[13] Sameiginleg nefnd um leiðsögumenn í mælifræði. Mat á mæligögnum: Leiðbeiningar um tjáningu óvissu í mælingum. JCGM 100:2008. Leiðrétt útgáfa 2010. 4.–7. Heimildarskjal

ALLAR GREINAR OG VÖRUUPPLÝSINGAR Á ÞESSARI VEFSÍÐU ERU EINVOLU TIL UPPLÝSINGAMIÐRÆÐINGAR OG FRÆÐSLA TILGANGUR.

Vörurnar sem gefnar eru upp á þessari vefsíðu eru eingöngu ætlaðar fyrir in vitro rannsóknir. In vitro rannsóknir (latína: *í gleri*, sem þýðir í glervöru) eru gerðar utan mannslíkamans. Þessar vörur eru ekki lyf, hafa ekki verið samþykktar af matvæla- og lyfjaeftirliti Bandaríkjanna (FDA) og má ekki nota til að koma í veg fyrir, meðhöndla eða lækna sjúkdóma, sjúkdóma eða kvilla. Það er stranglega bannað samkvæmt lögum að koma þessum vörum í manns- eða dýralíkamann í hvaða formi sem er.