Από την Cocer Peptides 
πριν από 26 ημέρες.
Ένα ποσοτικό αποτέλεσμα πεπτιδίου απαιτεί ένα καθορισμένο χημικό είδος, μια κατάλληλη βάση βαθμονόμησης και στοιχεία ότι ο χειρισμός του δείγματος διατηρεί την ποσότητα που μετράται. Η μάζα σκόνης, το ποσοστό χρωματογραφικής περιοχής και η συγκέντρωση πεπτιδίου στόχου περιγράφουν διαφορετικές ιδιότητες. Η αντιμετώπισή τους ως εναλλάξιμα μπορεί να προκαλέσει σφάλμα πριν γίνει η πρώτη μέτρηση. Αυτό το άρθρο εξετάζει την ανάλυση αμινοξέων, την απορρόφηση υπεριώδους, τη βαθμονομημένη υγρή χρωματογραφία, τη φασματομετρία μάζας αραίωσης ισοτόπων και τον ποσοτικό πυρηνικό μαγνητικό συντονισμό ως προσεγγίσεις για την ποσοτικοποίηση των πεπτιδίων. Εξηγεί τις πληροφορίες που παρέχει κάθε μέθοδος, τις υποθέσεις που απαιτούνται για τη μετατροπή του σήματος της σε ποσότητα και τους ελέγχους που απαιτούνται για ένα ερμηνεύσιμο αποτέλεσμα. Η συζήτηση αφορά εργαστηριακά υλικά και αναλυτικές λύσεις. Παρέχει ένα πλαίσιο για την επιλογή και την αξιολόγηση μιας διαδικασίας μέτρησης, χωρίς να ορίζει καθολικές συνθήκες λειτουργίας ή όρια αποδοχής.
Καθορίστε το μέτρο, δηλαδή την ποσότητα που πρόκειται να μετρηθεί, πριν επιλέξετε ένα όργανο. Παραδείγματα περιλαμβάνουν την ποσότητα ενός ανέπαφου πεπτιδίου σε ένα δείγμα, τη συγκέντρωση μάζας του σε ένα παρασκευασμένο διάλυμα ή το κλάσμα μάζας του σε ένα στερεό δείγμα όπως ελήφθη. Προσδιορίστε την ακολουθία, τις ομάδες τερματικών και τις σχετικές τροποποιήσεις. Δηλώστε εάν η αναφερόμενη μάζα περιλαμβάνει αντίθετα ιόντα ή περιγράφει μόνο το πεπτιδικό τμήμα. Το αποτέλεσμα χρειάζεται επίσης ένα καθορισμένο όριο δείγματος: το διαλυμένο τμήμα, ολόκληρο το παρασκεύασμα ή το υλικό που ανακτάται μετά από μια συγκεκριμένη λειτουργία.
Ένα ζυγισμένο στερεό μπορεί να περιέχει νερό, αντίθετα ιόντα, υπολειμματικούς διαλύτες και άλλα συστατικά. Μια μεγάλη κορυφή στόχου σε ένα υπεριώδες χρωματογράφημα δεν μετρά όλα αυτά τα συστατικά. Ο Wang και οι συνεργάτες του επέδειξαν μια προσέγγιση ισορροπίας μάζας που συνδύαζε μετρήσεις πολλών κατηγοριών ακαθαρσιών για να χαρακτηρίσει ένα συνθετικό πεπτιδικό υλικό. Αυτό επεξηγεί γιατί ένα ποσοστό χρωματογραφικής περιοχής δεν μπορεί αυτόματα να αντικαταστήσει το κλάσμα μάζας πεπτιδίου κατά την παρασκευή ενός ποσοτικού προτύπου. [1]
Ένας βαθμονομητής χρειάζεται μια εκχωρημένη ποσότητα κατάλληλη για τη μέτρηση, μαζί με την αβεβαιότητά της και τις συνθήκες υπό τις οποίες εφαρμόζεται αυτή η εκχώρηση. Ελέγξτε το πιστοποιητικό για την ακριβή παρτίδα, τη χημική μορφή, τη βάση αξίας και τις οδηγίες χειρισμού. Μια ετικέτα που δηλώνει χρωματογραφική καθαρότητα από μόνη της δεν παρέχει μια συγκέντρωση στόχο. Οι Bunk και Lowenthal περιγράφουν τη χρήση ανάλυσης αμινοξέων αραίωσης ισοτόπων στο NIST για την υποστήριξη των εκχωρήσεων συγκέντρωσης για υλικά αναφοράς πεπτιδίων και πρωτεϊνών. Μια τέτοια αντιστοίχιση απαιτεί μια τεκμηριωμένη διαδικασία μέτρησης και όχι ένα ονομαστικό βάρος σκόνης. [2]
Για ένα διάλυμα που παρασκευάζεται ποσοτικά από ένα υλικό με καθορισμένο κλάσμα μάζας στόχο, η συγκέντρωση μάζας είναι:
ρ = m × w / V
Εδώ, m είναι η μάζα του υλικού που ζυγίζεται, w είναι το κλάσμα μάζας πεπτιδίου στόχου στην ίδια βάση και V είναι ο τελικός όγκος του διαλύματος. Εάν το m είναι σε χιλιοστόγραμμα, το w σε χιλιοστόγραμμα ανά χιλιοστόγραμμα και το V σε χιλιοστόλιτρα, το ρ είναι σε χιλιοστόγραμμα ανά χιλιοστόλιτρο. Ο υπολογισμός προϋποθέτει πλήρη διάλυση και μεταφορά. Δεν επαληθεύει αυτές τις λειτουργίες. Η μετατροπή σε συγκέντρωση ποσότητας απαιτεί τη μοριακή μάζα του ρητά καθορισμένου χημικού είδους.
Προετοιμάστε μια ανεξάρτητη λύση ελέγχου όταν είναι εφικτό. Τα πρότυπα βαθμονόμησης και οι έλεγχοι που προέρχονται από ένα λανθασμένα εκχωρημένο απόθεμα μπορεί να συμφωνούν μεταξύ τους ενώ φέρουν το ίδιο σφάλμα. Διατηρήστε τα αρχεία προετοιμασίας αποθέματος και αραίωσης έτσι ώστε να μπορεί να ανακατασκευαστεί η πηγή κάθε εκχωρημένης συγκέντρωσης.
Επιλέξτε τη μέθοδο σύμφωνα με τη σύνθεση του δείγματος, την αναμενόμενη συγκέντρωση και την αβεβαιότητα που απαιτούνται για το πείραμα. Ένα σχετικά καθαρό υλικό αναφοράς και ένα μείγμα που περιέχει πολλά σχετικά πεπτίδια παρουσιάζουν διαφορετικά προβλήματα μέτρησης. Ο Πίνακας 1 συγκρίνει τις κύριες επιλογές που συζητούνται παρακάτω. Το περιοριστικό ερώτημα είναι εάν η μετρούμενη απόκριση μπορεί να αποδοθεί στον καθορισμένο στόχο με επαρκή εμπιστοσύνη.
Πίνακας 1 Επιλογές μέτρησης και οι κύριοι περιορισμοί τους
Μέθοδος |
Βάση ποσοτικοποίησης |
Περιορισμός για διερεύνηση |
Ανάλυση αμινοξέων |
Ποσότητες απελευθερωμένων αμινοξέων που σχετίζονται με τη σύνθεση της αλληλουχίας. |
Πληρότητα υδρόλυσης και συνεισφορές από άλλα πεπτίδια ή ελεύθερα αμινοξέα. |
Άμεση απορρόφηση UV |
Απορρόφηση που σχετίζεται με τη συγκέντρωση μέσω κατάλληλης απορροφητικότητας. |
Εξάρτηση ακολουθίας, απορρόφηση ρύπων και οπτικό υπόβαθρο. |
Βαθμονομημένο LC με ανίχνευση UV |
Στόχος η απόκριση κορυφής σε σύγκριση με τα καθορισμένα πρότυπα πεπτιδίων. |
Μη επιλυμένα στοιχεία και διαφορές στην απόκριση ή ανάκτηση δειγμάτων. |
Ισοτοπική αραίωση LC–MS |
Απόκριση αναλυόμενης ουσίας σε σχέση με ένα χαρακτηρισμένο εσωτερικό πρότυπο σημασμένο με ισότοπο. |
Παρεμβολές, εφέ μήτρας και η εκχωρηθείσα ποσότητα του εσωτερικού προτύπου. |
Ποσοτική NMR |
Ολοκληρώματα σημάτων που σχετίζονται με αριθμούς πυρήνων και μια ποσοτική αναφορά. |
Επικάλυψη σήματος, χαλάρωση και καταλληλότητα αναφοράς. |
Η ανάλυση αμινοξέων μετατρέπει πρώτα ένα πεπτίδιο σε μετρήσιμα συστατικά αμινοξέα. Για ένα υπόλειμμα που εμφανίζεται εάν το η απελευθέρωση ήταν πλήρης και καμία / άλλη πηγή δεν συνέβαλε σε αυτό νί φορές στην αλληλουχία, μια παρατηρούμενη ποσότητα ni θα αντιστοιχούσε σε μια ποσότητα πεπτιδίου ni ν i αμινοξύ. Συγκρίνετε εκτιμήσεις από διάφορα κατάλληλα υπολείμματα όπου το επιτρέπει η αλληλουχία. Η διαφωνία μπορεί να αποκαλύψει ένα πρόβλημα που διαφορετικά θα έκρυβε ο μέσος όρος.
Η υδρόλυση πρέπει να απελευθερώνει τα επιλεγμένα υπολείμματα χωρίς απαράδεκτη απώλεια ή μετατροπή των μετρούμενων αμινοξέων. Οι Bunk και Lowenthal τονίζουν ότι αυτές οι συνθήκες απαιτούν επικύρωση για κάθε αναλύτη. Ο Muñoz και οι συνεργάτες του αξιολόγησαν αρκετά αμινοξέα κατά την ποσοτικοποίηση των πρωτεϊνικών βαθμονομητών με αραίωση ισοτόπων, παρέχοντας ένα πειραματικό παράδειγμα χρήσης συμφωνίας μεταξύ εκτιμήσεων που βασίζονται σε υπολείμματα για την αξιολόγηση της υδρόλυσης. Οι συνθήκες που καθορίζονται για ένα υλικό δεν θα πρέπει να θεωρούνται επαρκείς για ένα διαφορετικό πεπτίδιο. [2,3]
Τα ελεύθερα αμινοξέα και άλλα πεπτίδια μπορούν να συνεισφέρουν στην υδρόλυση. Κατά συνέπεια, η ανάλυση αμινοξέων από μόνη της μπορεί να καθορίσει το συνολικό περιεχόμενο που σχετίζεται με τη σύνθεση χωρίς επιλεκτικό ποσοτικό προσδιορισμό της επιδιωκόμενης άθικτης αλληλουχίας. Συμπεριλάβετε κατάλληλα κενά υδρόλυσης και διερευνήστε αυτές τις συνεισφορές πριν ορίσετε μια τιμή στόχο. Χρησιμοποιήστε τη χημική ταυτότητα και τη μορφή του ελεύθερου αμινοξέος κατά τον υπολογισμό των ποσοτήτων του βαθμονομητή. Για παράδειγμα, το PubChem προσδιορίζει τη γλυκίνη ως CID 750. η εγγραφή της βάσης δεδομένων υποστηρίζει έλεγχο ταυτότητας, αλλά δεν πιστοποιεί το περιεχόμενο ενός υλικού αναφοράς αμινοξέων. [4]
Για ένα ομοιογενές διάλυμα μέσα σε ένα κατάλληλο εύρος οργάνων, η σχέση Beer–Lambert A = εlc συνδέει την απορρόφηση A με διορθωμένη τυφλό με μοριακή απορροφητικότητα ε, μήκος οπτικής διαδρομής l και συγκέντρωση ποσότητας c. Η απορροφητικότητα πρέπει να αντιστοιχεί στο πεπτίδιο, το μήκος κύματος και τις συνθήκες μέτρησης. Η απορρόφηση κοντά στα 280 nm εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από τα αρωματικά υπολείμματα και δεν μπορεί να χρησιμεύσει ως γενική μέτρηση συγκέντρωσης για κάθε πεπτίδιο. Οι Anthis και Clore ανέπτυξαν μια προσέγγιση βασισμένη σε ακολουθία στα 205 nm, δείχνοντας την αξία της λογιστικής για τη σύνθεση αντί της εφαρμογής ενός μόνο συντελεστή μετατροπής. [5]
Σε μικρότερα μήκη κύματος, η απορρόφηση διαλύτη και ρυθμιστικού διαλύματος μπορεί να γίνει περιοριστική. Χρησιμοποιήστε ένα κενό που ταιριάζει με τη σύνθεση, ελέγξτε το χρησιμοποιήσιμο οπτικό εύρος και συγκρίνετε τις κατάλληλες αραιώσεις. Η θολότητα ή μια απορροφητική ακαθαρσία μπορεί να προκαλέσει μια φαινομενική αλλαγή συγκέντρωσης που δεν σχετίζεται με τον στόχο. Ένα αποτέλεσμα άμεσης απορρόφησης θα πρέπει επομένως να περιλαμβάνει τις υποθέσεις σχετικά με τη σύνθεση του δείγματος από την οποία εξαρτάται.
Ο χρωματογραφικός διαχωρισμός μπορεί να βελτιώσει την επιλεκτικότητα πριν από τη μέτρηση με υπεριώδη ακτινοβολία, αλλά μια ποσοτική ανάλυση LC εξακολουθεί να απαιτεί μια κατάλληλη σχέση απόκρισης. Οι Kuipers και Gruppen μέτρησαν διαφορετικές συνεισφορές αμινοξέων και πεπτιδικών δεσμών στην απορρόφηση στα 214 nm. Τα ευρήματά τους εξηγούν γιατί οι ίσες περιοχές κορυφής από διαφορετικά πεπτίδια δεν χρειάζεται να αντιπροσωπεύουν ίσες ποσότητες. Για ποσοτικοποίηση στόχου, συγκρίνετε την επιλυμένη απόκριση στόχου με κατάλληλα εκχωρημένα πρότυπα και επαληθεύστε τη βαθμονόμηση υπό τις πραγματικές αναλυτικές συνθήκες. [6]
Στην αραίωση ισοτόπων LC-MS, η απόκριση του στόχου συγκρίνεται με εκείνη ενός προστιθέμενου ισοτοπικά επισημασμένου αντίστοιχου μέσω ενός καθορισμένου μοντέλου βαθμονόμησης. Επιβεβαιώστε την ταυτότητα, την εκχωρηθείσα ποσότητα και την ισοτοπική σύνθεση αυτού του προτύπου. Εξετάστε τη χρωματογραφική αντιστοιχία, τους σχετικούς διαύλους ιόντων και την πιθανή συμβολή μη επισημασμένου υλικού στο κανάλι-στόχο. Ο Stoyanov και οι συνεργάτες του κατέδειξαν πώς η μη καταγεγραμμένη ετερογένεια στα εσωτερικά πρότυπα πεπτιδίων μπορεί να επηρεάσει την προκύπτουσα συγκέντρωση στόχο. Η επισήμανση από μόνη της δεν αποτελεί αξιόπιστη ποσοτική αναφορά. [7]
Προσθέστε το εσωτερικό πρότυπο σε ένα στάδιο κατάλληλο για τις απώλειες που προορίζεται να παρακολουθήσει και βεβαιωθείτε ότι συμπεριφέρεται επαρκώς όπως η αναλυόμενη ουσία. Ένα πρότυπο που εισάγεται μετά από μια εξαγωγή δεν μπορεί να διορθώσει τις απώλειες που σημειώθηκαν κατά τη διάρκεια αυτής της εξαγωγής. Ακόμη και μια πρώιμη προσθήκη απαιτεί επαρκή ανάμειξη και συγκρίσιμη συμπεριφορά. Διατηρήστε τόσο τις απόλυτες αποκρίσεις όσο και την αναλογία τους: μια σταθερή αναλογία μπορεί να κρύψει μεγάλες αλλαγές στην ευαισθησία ή στο χειρισμό του δείγματος που αξίζουν διερεύνηση.
Επιλέξτε μεταβάσεις ή σήματα εξαγόμενων ιόντων που είναι αποδεδειγμένα κατάλληλα για τον στόχο στη μήτρα του δείγματος. Μια αντίστοιχη τιμή μάζας προς φόρτιση δεν αποτελεί από μόνη της απόδειξη ότι απουσιάζει ένα παρεμβαλλόμενο στοιχείο. Ένα άθικτο αποτέλεσμα πεπτιδίου δεν θα πρέπει επίσης να μετατραπεί σε συγκέντρωση μητρικής πρωτεΐνης χωρίς να καθιερωθούν χωριστά οι σχέσεις πέψης και ανάκτησης.
Το ποσοτικό NMR πρωτονίων συσχετίζει το ολοκληρωμένο σήμα ενός εκχωρημένου συντονισμού με τον αριθμό των συνεισφερόντων πυρήνων και μια ποσοτική αναφορά. Για ένα πείραμα εσωτερικής αναφοράς, η σχέση ποσού μπορεί να εκφραστεί ως:
n x = n r × ( I x / N x ) / ( I r / N r )
Οι δείκτες x και r δηλώνουν αναλύτη και αναφορά. I είναι το ολοκληρωμένο σήμα και N ο αριθμός των πρωτονίων που αντιπροσωπεύεται από αυτό το σήμα. n r είναι το εκχωρημένο ποσό αναφοράς. Η έκφραση προϋποθέτει ποσοτικά συγκρίσιμη απόκριση σήματος και σωστή εκχώρηση κορυφής. Για τη μετατροπή του αποτελέσματος σε πεπτιδική μάζα απαιτείται η μοριακή μάζα στη δηλωμένη βάση αναφοράς.
Ο Li και οι συνεργάτες του συνέκριναν το qNMR, την ανάλυση αμινοξέων και τη βαθμονομημένη HPLC σε μια συλλογική μελέτη ενός πεπτιδικού υλικού αναφοράς. Η εργασία κατέδειξε την πρακτική χρήση του qNMR και επίσης έδειξε ότι οι συγκρίσεις μεθόδων εξαρτώνται από τον τρόπο με τον οποίο αντιμετωπίζονται τα πρότυπα και οι αβεβαιότητες. Τα ευρήματά του δεν καθιερώνουν μια καθολική κατάταξη για όλα τα δείγματα πεπτιδίων. [8]
Διαχωρίστε την επιλεγμένη αναλυόμενη ουσία και τα σήματα αναφοράς από ακαθαρσίες, διαλύτη και μεταξύ τους. Καθορίστε κατάλληλες συνθήκες παλμού και χαλάρωσης, όρια σήματος προς θόρυβο και ολοκλήρωσης. Η καθοδήγηση BIPM εξηγεί γιατί η χαλάρωση πρέπει να αξιολογηθεί για τα σήματα στο πραγματικό μείγμα. Μια αναφορά χημικής μετατόπισης δεν είναι αυτόματα ένα ποσοτικό πρότυπο. Οι στενά σχετιζόμενες ακαθαρσίες που μοιράζονται τον ενσωματωμένο συντονισμό μπορούν να συμβάλλουν στη μετρούμενη ποσότητα ακόμη και όταν το ολοκλήρωμα είναι εξαιρετικά επαναλήψιμο. [9]
Προετοιμάστε τα επίπεδα βαθμονόμησης που καλύπτουν την προβλεπόμενη απόκριση του δείγματος και αξιολογήστε το επιλεγμένο μοντέλο απόκρισης. Εξετάστε τα υπολείμματα και τις συγκεντρώσεις που υπολογίστηκαν από την καμπύλη. Ένας υψηλός συντελεστής προσδιορισμού, R², δεν μπορεί από μόνος του να δημιουργήσει αποδεκτή βαθμονόμηση, ειδικά κοντά στο κάτω άκρο του εύρους. Η Eurachem συνιστά την αξιολόγηση της συμπεριφοράς παλινδρόμησης και τη στάθμιση όπου η διακύμανση της απόκρισης αλλάζει με τη συγκέντρωση. Επιλέξτε το μοντέλο χρησιμοποιώντας πειραματικά στοιχεία και όχι την εμφάνιση μιας γραφικής γραμμής. [10]
Χρησιμοποιήστε ανεξάρτητα προετοιμασμένα στοιχεία ελέγχου για να αξιολογήσετε την απόδοση εντός του εύρους. Καθορίστε τη χαμηλότερη συγκέντρωση στην οποία μπορεί να υποστηριχθεί η απαιτούμενη ακρίβεια και προκατάληψη. Η ανίχνευση μόνο ενός σήματος είναι ανεπαρκής. Για δείγματα που απαιτούν αραίωση, αποδείξτε ότι η αραίωση διατηρεί ένα έγκυρο αποτέλεσμα. Καταγράψτε τα κριτήρια αποδοχής πριν από την αξιολόγηση της ακολουθίας δειγμάτων και διατηρήστε τον λόγο για οποιοδήποτε εξαιρούμενο σημείο βαθμονόμησης. Εφαρμόστε κριτήρια που ταιριάζουν στον αναλυτικό στόχο, χωρίς να εισάγετε αριθμητικά όρια από μια άσχετη ανάλυση.
Αξιολογήστε τις περιόδους διάλυσης, μεταφοράς και διατήρησης στις συγκεντρώσεις που χρησιμοποιούνται για τη μέτρηση. Ο Goebel-Stengel και οι συνεργάτες του απέδειξαν ότι η ανάκτηση πεπτιδίου μπορεί να εξαρτάται από την επιφάνεια που έρχεται σε επαφή. Ανεξάρτητες παρασκευές δειγμάτων βοηθούν στην αποκάλυψη αυτής της συμβολής, ενώ οι επαναλαμβανόμενες μετρήσεις οργάνων από το ίδιο φιαλίδιο δεν μπορούν να αναπαράγουν μια προηγούμενη απώλεια παρασκευάσματος. Συγκρίνετε τα κατάλληλα νωπά και διατηρημένα δείγματα και διερευνήστε την ανάκτηση μετά από οποιοδήποτε φιλτράρισμα ή καθαρισμό. [11]
Για το LC-MS, μια αλλαγή στην απόκριση μπορεί να αντανακλά μια αλλαγή στον ιονισμό που προκαλείται από τα συστατικά του δείγματος συνέκλουσης. Ο Matuszewski και οι συνεργάτες του περιέγραψαν πειράματα που διακρίνουν τα αποτελέσματα της μήτρας από την ανάκτηση εξαγωγής. Εφαρμόζοντας σε μια πεπτιδική μέθοδο, οι συγκρίσεις μεταξύ καθαρών προτύπων, τυφλά εκχυλίσματα ενισχυμένα μετά την εκχύλιση και δείγματα ενισχυμένα πριν από την εκχύλιση μπορούν να βοηθήσουν στο διαχωρισμό αυτών των επιρροών, υπό την προϋπόθεση ότι οι συγκεντρώσεις, οι όγκοι και οι ενδογενείς συνεισφορές αντιμετωπίζονται με συνέπεια. Αξιολογήστε την εσωτερικά κανονικοποιημένη απόκριση καθώς και τα μεμονωμένα σήματα. [12]
Συμπεριλάβετε κενά που απαντούν σε συγκεκριμένες ερωτήσεις. Ένα κενό αντιδραστηρίου εξετάζει το εισαγόμενο υπόβαθρο. ένα κενό αφού ένα συγκεντρωμένο δείγμα εξετάζει τη μεταφορά. Όπου δεν είναι διαθέσιμος ένας πραγματικά κενός πίνακας δειγμάτων, τεκμηριώστε τον εναλλακτικό σχεδιασμό και τους περιορισμούς του. Ένα πείραμα ακίδας αξιολογεί την ανάκτηση του προστιθέμενου υλικού υπό τις δοκιμασμένες συνθήκες. δεν αποδεικνύει ότι μια αρχικά παρούσα αναλυόμενη ουσία ανακτήθηκε πλήρως ή απαλλαγμένη από παρεμβολές.
Η αξιολόγηση της αβεβαιότητας θα πρέπει να ακολουθεί το μοντέλο μέτρησης και να περιλαμβάνει τις συνεισφορές με επιρροή. Αυτά μπορεί να προκύψουν από την εκχώρηση τιμής βαθμονομητή, τη ζύγιση και την αραίωση, την ανάκτηση προετοιμασίας, τη βαθμονόμηση και την επαναληψιμότητα. Λάβετε υπόψη τις κοινόχρηστες εισροές και συσχετίσεις όπου είναι απαραίτητο. Ο Οδηγός JCGM για την έκφραση της αβεβαιότητας στη μέτρηση παρέχει το πλαίσιο για το συνδυασμό τέτοιων πληροφοριών και την αναφορά του αποτελέσματος. Μια μικρή τυπική απόκλιση από επαναλαμβανόμενες μετρήσεις περιγράφει μόνο τη διακύμανση που αντιπροσωπεύουν αυτές οι μετρήσεις. [13]
Αναφέρετε τα αναγνωριστικά δείγματος και παρτίδας, καθορισμένα είδη πεπτιδίων, μετρούμενη ποσότητα, μονάδα, έκδοση μεθόδου και βάση βαθμονόμησης. Αναφέρετε τον αριθμό και τον τύπο των ανεξάρτητων σκευασμάτων και τον τρόπο με τον οποίο εφαρμόστηκε οποιαδήποτε διόρθωση αραίωσης ή ανάκτησης. Εάν αναφέρεται διευρυμένη αβεβαιότητα, προσδιορίστε τον παράγοντα κάλυψης και την ερμηνεία που δικαιολογείται από την αξιολόγηση. Διατηρήστε τα υποκείμενα χρωματογραφήματα ή φάσματα, τις αποφάσεις ολοκλήρωσης και τα αποτελέσματα ελέγχου.
Όταν οι μέθοδοι διαφωνούν, συγκρίνετε πρώτα τη χημική τους επιλεκτικότητα και τις βάσεις αναφοράς. Μια εκτίμηση που βασίζεται σε προϊόν υδρόλυσης, μια ανάλυση άθικτου πεπτιδίου και μια μάζα σκόνης μπορεί να αναφέρονται σε διαφορετικές ποσότητες. Επιλύστε αυτή τη διαφορά πριν αποδώσετε διαφωνία στην απόδοση του οργάνου. Το χρήσιμο αποτέλεσμα είναι μια ποσότητα που συνδέεται με ένα καθορισμένο δείγμα και υποστηρίζεται από ένα ανιχνεύσιμο πειραματικό αρχείο.
Πεδίο έρευνας. Αυτό το άρθρο αφορά την αναλυτική ποσοτικοποίηση πεπτιδικών υλικών σε εργαστηριακά δείγματα. Δεν παρέχει οδηγίες για ανθρώπινη ή κτηνιατρική χρήση και δεν ισχυρίζεται για βιολογική αποτελεσματικότητα, κλινική καταλληλότητα ή ρυθμιστική έγκριση. Κάθε διαδικασία μέτρησης απαιτεί αξιολόγηση για το επιδιωκόμενο δείγμα και τον εργαστηριακό στόχο.
[1] Wang X, Zhang F, Li H, et al. Προσδιορισμός καθαρότητας συνθετικού γλυκαγόνου χρησιμοποιώντας προσέγγιση ισορροπίας μάζας. Επιστημονικές Εκθέσεις. 2020; 10:4423. doi: 10.1038/s41598-020-61109-9
[2] Bunk DM, Lowenthal MS. Υγρή χρωματογραφία αραίωσης ισοτόπων- φασματομετρία μάζας σε σειρά για ποσοτική ανάλυση αμινοξέων. Στο: Amino Acid Analysis: Methods and Protocols. 2η έκδ. Μέθοδοι στη Μοριακή Βιολογία. 2019; 2030. Κεφάλαιο 12. doi: 10.1007/978-1-4939-9639-1_12
[3] Muñoz A, Kral R, Schimmel H. Ποσοτικοποίηση βαθμονομητών πρωτεϊνών με ανάλυση αμινοξέων χρησιμοποιώντας φασματομετρία μάζας αραίωσης ισοτόπων. Αναλυτική Βιοχημεία. 2011; 408 (1): 124–131. doi: 10.1016/j.ab.2010.08.037
[4] Εθνικό Κέντρο Πληροφοριών Βιοτεχνολογίας. Περίληψη ένωσης PubChem για CID 750, Glycine. Πρόσβαση στις 2 Νοεμβρίου 2026. Έγγραφο πηγής
[5] Anthis NJ, Clore GM. Αλληλουχικός προσδιορισμός συγκεντρώσεων πρωτεΐνης και πεπτιδίου με απορρόφηση στα 205 nm. Πρωτεϊνική Επιστήμη. 2013, 22(6):851–858. doi: 10.1002/pro.2253
[6] Kuipers BJH, Gruppen H. Πρόβλεψη των συντελεστών γραμμομοριακής εξάλειψης πρωτεϊνών και πεπτιδίων χρησιμοποιώντας απορρόφηση UV των συστατικών αμινοξέων στα 214 nm για να καταστεί δυνατή η ποσοτική ανάλυση υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης αντίστροφης φάσης-φασματομετρία μάζας. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2007;55(14):5445–5451. doi: 10.1021/jf070337l
[7] Stoyanov AV, Rogatsky E, Stein D, et al. Δοκιμασία αραίωσης ισοτόπων στην ποσοτικοποίηση πεπτιδίων: Η πρόκληση της μικροετερογένειας του εσωτερικού προτύπου. Κλινικές Εφαρμογές Proteomics. 2013; 7 (11–12): 825–828. doi: 10.1002/prca.201200130
[8] Li C, Bhavaraju S, Melanson JE, et al. Έρευνα μεθόδων ποσοτικοποίησης πεπτιδίων και σύγκριση της αναπαραγωγιμότητάς τους: Μια μελέτη περίπτωσης με χρήση ωκυτοκίνης. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2019; 166:105–112. doi: 10.1016/j.jpba.2018.12.028
[9] Westwood S, Stoppacher N, Martos G, et al. Εσωτερικά πρότυπα δεδομένα αναφοράς για qNMR: 3,5-δις(τριφθορομεθυλ)βενζοϊκό οξύ. Αναφορά BIPM-2019/02, ISRD-05. Έκδοση 1.0; 13 Μαρτίου 2019. Ενότητα 3. Έγγραφο πηγής
[10] Cantwell H, ed. The Fitness for Purpose of Analytical Methods: A Laboratory Guide to Method Validation and Related Topics. 3η έκδ. Eurachem; 2025. Ενότητες 5.2–5.4. Έγγραφο πηγής
[11] Goebel-Stengel M, Stengel A, Taché Y, Reeve JR Jr. Η σημασία της χρήσης των βέλτιστων πλαστικών και γυαλικών σε μελέτες που αφορούν πεπτίδια. Αναλυτική Βιοχημεία. 2011; 414 (1): 38–46. doi: 10.1016/j.ab.2011.02.009
[12] Matuszewski BK, Constanzer ML, Chavez-Eng CM. Στρατηγικές για την αξιολόγηση της επίδρασης μήτρας σε ποσοτικές βιοαναλυτικές μεθόδους βασισμένες σε HPLC-MS/MS. Αναλυτική Χημεία. 2003;75(13):3019–3030. doi: 10.1021/ac020361s
[13] Μεικτή Επιτροπή για τους Οδηγούς στη Μετρολογία. Evaluation of Measurement Data: Guide to the Expression of Uncertainty in Measurement. JCGM 100:2008. Διορθωμένη έκδοση 2010. Ενότητες 4–7. Έγγραφο πηγής
ΟΛΑ ΤΑ ΑΡΘΡΑ ΚΑΙ ΟΙ ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΕΣ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΠΟΥ ΠΑΡΕΧΟΝΤΑΙ ΣΕ ΑΥΤΗ ΤΗΝ ΙΣΤΟΣΕΛΙΔΑ ΕΙΝΑΙ ΑΠΟΚΛΕΙΣΤΙΚΑ ΓΙΑ ΔΙΑΔΟΣΗ ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΩΝ ΚΑΙ ΕΚΠΑΙΔΕΥΤΙΚΟΥΣ ΣΚΟΠΟΥΣ.
Τα προϊόντα που παρέχονται σε αυτόν τον ιστότοπο προορίζονται αποκλειστικά για έρευνα in vitro. Έρευνα in vitro (λατινικά: *in glass*, που σημαίνει σε γυάλινα σκεύη) διεξάγεται έξω από το ανθρώπινο σώμα. Αυτά τα προϊόντα δεν είναι φαρμακευτικά προϊόντα, δεν έχουν εγκριθεί από τον Οργανισμό Τροφίμων και Φαρμάκων των ΗΠΑ (FDA) και δεν πρέπει να χρησιμοποιούνται για την πρόληψη, τη θεραπεία ή τη θεραπεία οποιασδήποτε ιατρικής πάθησης, ασθένειας ή πάθησης. Απαγορεύεται αυστηρά από το νόμο η εισαγωγή αυτών των προϊόντων στο σώμα του ανθρώπου ή του ζώου σε οποιαδήποτε μορφή.
