Di Cocer Peptidi 
26 giorni fa.
Un risultato quantitativo del peptide richiede una specie chimica definita, una base di calibrazione adeguata e la prova che la manipolazione del campione preservi la quantità misurata. La massa della polvere, la percentuale dell'area cromatografica e la concentrazione del peptide target descrivono proprietà diverse. Trattarli come intercambiabili può introdurre un errore prima che venga effettuata la prima misurazione. Questo articolo esamina l'analisi degli amminoacidi, l'assorbanza ultravioletta, la cromatografia liquida calibrata, la spettrometria di massa con diluizione isotopica e la risonanza magnetica nucleare quantitativa come approcci alla quantificazione dei peptidi. Spiega le informazioni fornite da ciascun metodo, i presupposti necessari per convertire il segnale in un importo e i controlli necessari per un risultato interpretabile. La discussione riguarda materiali di laboratorio e soluzioni analitiche. Fornisce un quadro per la selezione e la valutazione di una procedura di misurazione, senza prescrivere condizioni operative universali o limiti di accettazione.
Specificare il misurando, ovvero la grandezza che si intende misurare, prima di selezionare uno strumento. Gli esempi includono la quantità di un peptide intatto in un'aliquota, la sua concentrazione in massa in una soluzione preparata o la sua frazione in massa in un campione solido così come ricevuto. Identificare la sequenza, i gruppi di terminali e le modifiche rilevanti. Indicare se la massa riportata include controioni o descrive solo la porzione peptidica. Il risultato necessita inoltre di un confine definito del campione: la porzione disciolta, l'intera preparazione o il materiale recuperato dopo un'operazione specifica.
Un solido pesato può contenere acqua, controioni, solventi residui e altri componenti. Un ampio picco target in un cromatogramma ultravioletto non misura tutti questi componenti. Wang e colleghi hanno dimostrato un approccio basato sul bilancio di massa che combinava misurazioni di diverse classi di impurità per caratterizzare un materiale peptidico sintetico. Ciò illustra perché una percentuale di area cromatografica non può essere automaticamente sostituita con la frazione di massa peptidica durante la preparazione di uno standard quantitativo. [1]
Un calibratore necessita di una quantità assegnata adeguata alla misurazione, insieme alla sua incertezza e alle condizioni alle quali si applica tale assegnazione. Controlla il certificato per il lotto esatto, la forma chimica, il valore base e le istruzioni per la movimentazione. Un'etichetta che dichiara la purezza cromatografica da sola non fornisce una concentrazione target. Bunk e Lowenthal descrivono l'uso dell'analisi degli amminoacidi con diluizione isotopica presso il NIST per supportare le assegnazioni di concentrazione per materiali di riferimento peptidici e proteici. Tale incarico richiede una procedura di misurazione documentata, piuttosto che un peso nominale della polvere. [2]
Per una soluzione preparata quantitativamente da un materiale con una frazione di massa target stabilita, la concentrazione di massa è:
ρ = m × w / V
Qui, m è la massa del materiale pesato, w è la frazione di massa peptidica target sulla stessa base e V è il volume della soluzione finale. Se m è in milligrammi, w in milligrammi per milligrammo e V in millilitri, ρ è in milligrammi per millilitro. Il calcolo presuppone lo scioglimento e il trasferimento completi. Non verifica tali operazioni. La conversione in concentrazione quantitativa richiede la massa molare delle specie chimiche esplicitamente definite.
Preparare una soluzione di controllo indipendente quando possibile. Gli standard di calibrazione e i controlli derivati da uno stock assegnato in modo errato possono concordare tra loro pur presentando lo stesso errore. Conservare i registri di preparazione e diluizione della miscela in modo da poter ricostruire la fonte di ogni concentrazione assegnata.
Selezionare il metodo in base alla composizione del campione, alla concentrazione prevista e all'incertezza necessaria per l'esperimento. Un materiale di riferimento relativamente puro e una miscela contenente diversi peptidi correlati presentano diversi problemi di misurazione. La tabella 1 mette a confronto le principali opzioni discusse di seguito. La domanda limitante è se la risposta misurata può essere attribuita al target definito con sufficiente sicurezza.
Tabella 1 Opzioni di misurazione e loro principali limitazioni
Metodo |
Base di quantificazione |
Limitazione dell'indagine |
Analisi degli aminoacidi |
Quantità di amminoacidi rilasciati correlati alla composizione della sequenza. |
Completezza dell'idrolisi e contributi di altri peptidi o amminoacidi liberi. |
Assorbimento UV diretto |
Assorbanza correlata alla concentrazione attraverso un'assorbenza adeguata. |
Dipendenza dalla sequenza, assorbimento dei contaminanti e fondo ottico. |
LC calibrato con rilevamento UV |
Risposta di picco target rispetto agli standard peptidici assegnati. |
Componenti irrisolti e differenze nella risposta o nel recupero del campione. |
Diluizione isotopica LC-MS |
Risposta dell'analita relativa a uno standard interno marcato con isotopi caratterizzato. |
Interferenze, effetti matrice e importo assegnato dello standard interno. |
NMR quantitativa |
Integrali di segnale relativi al numero di nuclei e riferimento quantitativo. |
Sovrapposizione del segnale, rilassamento e idoneità del riferimento. |
L'analisi degli amminoacidi converte innanzitutto un peptide in amminoacidi costituenti misurabili. Per un residuo che ricorre ν i volte nella sequenza, una quantità osservata n i corrisponderebbe a una quantità di peptide n i / ν i se il rilascio fosse completo e nessun'altra fonte contribuisse a quell'amminoacido. Confrontare le stime di diversi residui idonei laddove la sequenza lo consente. Il disaccordo può rivelare un problema che la media altrimenti nasconderebbe.
L'idrolisi deve rilasciare i residui selezionati senza una perdita o conversione inaccettabile degli amminoacidi misurati. Bunk e Lowenthal sottolineano che queste condizioni richiedono la validazione per ciascun analita. Muñoz e colleghi hanno valutato diversi amminoacidi quantificando i calibranti proteici mediante diluizione isotopica, fornendo un esempio sperimentale di utilizzo dell'accordo tra stime basate sui residui per valutare l'idrolisi. Le condizioni stabilite per un materiale non dovrebbero essere ritenute adeguate per un peptide diverso. [2,3]
Gli aminoacidi liberi e altri peptidi possono contribuire all'idrolizzato. Di conseguenza, l'analisi degli amminoacidi da sola può stabilire il contenuto correlato alla composizione totale senza quantificare selettivamente la sequenza intatta prevista. Includere idonei campioni di idrolisi e analizzare questi contributi prima di assegnare un valore target. Utilizzare l'identità chimica e la forma dell'amminoacido libero quando si calcolano le quantità del calibratore. Ad esempio, PubChem identifica la glicina come CID 750; il record del database supporta il controllo dell'identità ma non certifica il contenuto di un materiale di riferimento aminoacidico. [4]
Per una soluzione omogenea all'interno di un intervallo strumentale appropriato, la relazione Beer-Lambert A = εlc collega l'assorbanza A corretta in bianco con l'assorbenza molare ε, la lunghezza del percorso ottico l e la concentrazione della quantità c. L'assorbenza deve corrispondere al peptide, alla lunghezza d'onda e alle condizioni di misurazione. L'assorbanza vicino a 280 nm dipende fortemente dai residui aromatici e non può servire come misura generale della concentrazione per ogni peptide. Anthis e Clore hanno sviluppato un approccio basato sulla sequenza a 205 nm, mostrando il valore di tenere conto della composizione piuttosto che applicare un singolo fattore di conversione. [5]
A lunghezze d'onda più corte, l'assorbimento del solvente e del tampone può diventare limitante. Utilizzare un bianco con la stessa composizione, controllare il campo ottico utilizzabile e confrontare le diluizioni adatte. La torbidità o un'impurità assorbente possono produrre un apparente cambiamento di concentrazione non correlato al target. Un risultato di assorbanza diretta dovrebbe quindi contenere le ipotesi sulla composizione del campione da cui dipende.
La separazione cromatografica può migliorare la selettività prima della misurazione UV, ma un test LC quantitativo richiede comunque una relazione di risposta adeguata. Kuipers e Gruppen hanno misurato i diversi contributi degli aminoacidi e dei legami peptidici all'assorbanza a 214 nm. I loro risultati spiegano perché non è necessario che aree di picco uguali di diversi peptidi rappresentino quantità uguali. Per la quantificazione del target, confrontare la risposta del target risolta con gli standard assegnati adeguati e verificare la calibrazione nelle condizioni analitiche effettive. [6]
Nella LC-MS a diluizione isotopica, la risposta del target viene confrontata con quella di una controparte marcata isotopicamente aggiunta attraverso un modello di calibrazione definito. Confermare l'identità, la quantità assegnata e la composizione isotopica di tale standard. Esaminare la corrispondenza cromatografica, i canali ionici rilevanti e il possibile contributo di materiale non marcato al canale target. Stoyanov e colleghi hanno illustrato come un'eterogeneità non contabilizzata negli standard interni dei peptidi possa influenzare la concentrazione target risultante. L'etichettatura da sola non costituisce un riferimento quantitativo affidabile. [7]
Aggiungere lo standard interno in una fase adeguata alle perdite che si intende monitorare e stabilire che si comporti in modo sufficientemente simile all'analita. Uno standard introdotto dopo un'estrazione non può correggere le perdite verificatesi durante l'estrazione. Anche un'aggiunta anticipata richiede una miscelazione adeguata e un comportamento comparabile. Conservare sia le risposte assolute che il loro rapporto: un rapporto stabile può nascondere grandi cambiamenti nella sensibilità o nella gestione del campione che meritano di essere indagati.
Selezionare le transizioni o i segnali di ioni estratti che sono dimostrabilmente adatti al target nella matrice del campione. Un valore corrispondente massa-carica non è, di per sé, la prova che un componente interferente sia assente. Inoltre, un risultato peptidico intatto non deve essere convertito in una concentrazione di proteina madre senza stabilire separatamente le relazioni di digestione e recupero.
La NMR protonica quantitativa mette in relazione il segnale integrato di una risonanza assegnata con il numero di nuclei contribuenti e un riferimento quantitativo. Per un esperimento a riferimento interno, la relazione tra gli importi può essere espressa come:
n x = n r × ( io x / N x ) / ( io r / N r )
I pedici x e r denotano analita e riferimento. I è il segnale integrato e N il numero di protoni rappresentati da quel segnale; nr è l'importo di riferimento assegnato. L'espressione presuppone una risposta del segnale quantitativamente comparabile e una corretta assegnazione dei picchi. La conversione del risultato in massa peptidica richiede la massa molare sulla base di reporting indicata.
Li e colleghi hanno confrontato qNMR, analisi degli amminoacidi e HPLC calibrata in uno studio collaborativo di un materiale di riferimento peptidico. Il lavoro ha dimostrato l'uso pratico della qNMR e ha inoltre dimostrato che i confronti tra metodi dipendono dal modo in cui vengono trattati gli standard e le incertezze. I suoi risultati non stabiliscono una classifica universale per tutti i campioni di peptidi. [8]
Risolvere l'analita scelto e i segnali di riferimento dalle impurità, dal solvente e da altri. Stabilire condizioni adeguate di impulso e rilassamento, rapporto segnale-rumore e confini di integrazione. La guida BIPM spiega perché il rilassamento deve essere valutato per i segnali nella miscela reale. Un riferimento al Chemical Shift non è automaticamente uno standard quantitativo. Impurezze strettamente correlate che condividono la risonanza integrata possono contribuire alla quantità misurata anche quando l'integrale è altamente ripetibile. [9]
Preparare i livelli di calibrazione che coprono la risposta del campione prevista e valutare il modello di risposta scelto. Esaminare i residui e le concentrazioni calcolate dalla curva. Un coefficiente di determinazione elevato, R², non può da solo stabilire una calibrazione accettabile, soprattutto vicino al limite inferiore dell'intervallo. Eurachem raccomanda di valutare il comportamento di regressione e di considerare la ponderazione laddove la varianza della risposta cambia con la concentrazione. Scegli il modello utilizzando prove sperimentali piuttosto che l'aspetto di una linea tracciata. [10]
Utilizzare controlli preparati in modo indipendente per valutare le prestazioni all'interno dell'intervallo. Stabilire la concentrazione più bassa alla quale è possibile supportare la precisione e la distorsione richieste; il solo rilevamento del segnale non è sufficiente. Per i campioni che richiedono diluizione, dimostrare che la diluizione preserva un risultato valido. Registrare i criteri di accettazione prima di valutare la sequenza del campione e conservare il motivo di qualsiasi punto di calibrazione escluso. Applicare criteri adatti all'obiettivo analitico, senza importare limiti numerici da un test non correlato.
Valutare la dissoluzione, i trasferimenti e i periodi di mantenimento alle concentrazioni utilizzate per la misurazione. Goebel-Stengel e colleghi hanno dimostrato che il recupero del peptide può dipendere dalla superficie contattata. Preparazioni indipendenti dei campioni aiutano a rivelare questo contributo, mentre misurazioni ripetute dello strumento dalla stessa fiala non possono riprodurre una precedente perdita di preparazione. Confrontare le aliquote fresche e quelle conservate appropriate e analizzare il recupero dopo qualsiasi filtrazione o pulizia. [11]
Per LC–MS, una variazione nella risposta può riflettere una variazione nella ionizzazione causata dalla coeluizione dei costituenti del campione. Matuszewski e colleghi hanno descritto esperimenti che distinguono gli effetti della matrice dal recupero dell'estrazione. Applicati a un metodo peptidico, i confronti tra standard puri, estratti bianchi fortificati dopo l'estrazione e campioni fortificati prima dell'estrazione possono aiutare a separare queste influenze, a condizione che concentrazioni, volumi e contributi endogeni siano gestiti in modo coerente. Valutare la risposta normalizzata secondo lo standard interno nonché i singoli segnali. [12]
Includi spazi vuoti che rispondano a domande specifiche. Un bianco reagente esamina lo sfondo introdotto; un bianco dopo che un campione concentrato esamina il carryover. Laddove non sia disponibile una matrice del campione veramente vuota, documentare il progetto alternativo e le sue limitazioni. Un esperimento di picco valuta il recupero del materiale aggiunto nelle condizioni testate; non dimostra che un analita originariamente presente sia stato completamente recuperato o esente da interferenze.
La valutazione dell’incertezza dovrebbe seguire il modello di misurazione e includere i contributi influenti. Questi possono derivare dall'assegnazione del valore del calibratore, dalla pesatura e dalla diluizione, dal recupero della preparazione, dalla calibrazione e dalla ripetibilità. Tenere conto degli input condivisi e delle correlazioni, ove pertinente. La Guida JCGM all'espressione dell'incertezza nella misurazione fornisce il quadro per combinare tali informazioni e riportare il risultato. Una piccola deviazione standard da misurazioni ripetute descrive solo la variazione rappresentata da tali misurazioni. [13]
Riportare gli identificatori del campione e del lotto, le specie peptidiche definite, la quantità misurata, l'unità, la versione del metodo e la base di calibrazione. Indicare il numero e il tipo di preparazioni indipendenti e come è stata applicata la correzione di diluizione o recupero. Se viene riportata l’incertezza estesa, identificare il fattore di copertura e l’interpretazione giustificata dalla valutazione. Conserva i cromatogrammi o gli spettri sottostanti, le decisioni di integrazione e i risultati dei controlli.
Quando i metodi non sono d'accordo, confrontare innanzitutto la loro selettività chimica e le basi di reporting. Una stima basata sull'idrolizzato, un test del peptide intatto risolto e una massa di polvere possono fare riferimento a quantità diverse. Risolvi questa differenza prima di attribuire il disaccordo alla performance dello strumento. Il risultato utile è una quantità legata ad un campione definito e supportata da un record sperimentale tracciabile.
Ambito di ricerca. Questo articolo riguarda la quantificazione analitica dei materiali peptidici nei campioni di laboratorio. Non fornisce istruzioni per l'uso umano o veterinario e non fa alcuna dichiarazione sull'efficacia biologica, sull'idoneità clinica o sull'approvazione normativa. Ciascuna procedura di misurazione richiede una valutazione del campione previsto e dell'obiettivo del laboratorio.
[1] Wang X, Zhang F, Li H, et al. Determinazione della purezza del glucagone sintetico utilizzando un approccio di bilancio di massa. Rapporti scientifici. 2020;10:4423. doi: 10.1038/s41598-020-61109-9
[2] Castello DM, Lowenthal MS. Cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem a diluizione isotopica per l'analisi quantitativa degli aminoacidi. In: Analisi degli amminoacidi: metodi e protocolli. 2a ed. Metodi in biologia molecolare. 2019;2030. Capitolo 12. doi: 10.1007/978-1-4939-9639-1_12
[3] Muñoz A, Kral R, Schimmel H. Quantificazione dei calibranti proteici mediante analisi degli amminoacidi utilizzando la spettrometria di massa con diluizione isotopica. Biochimica analitica. 2011;408(1):124–131. doi: 10.1016/j.ab.2010.08.037
[4] Centro nazionale per l'informazione sulle biotecnologie. Riepilogo dei composti PubChem per CID 750, Glicina. Accesso effettuato il 2 novembre 2026. Documento di origine
[5] Anthis NJ, Clore GM. Determinazione sequenza specifica delle concentrazioni di proteine e peptidi mediante assorbanza a 205 nm. Scienza delle proteine. 2013;22(6):851–858. doi: 10.1002/pro.2253
[6] Kuipers BJH, Gruppen H. Previsione dei coefficienti di estinzione molare di proteine e peptidi utilizzando l'assorbimento UV degli amminoacidi costituenti a 214 nm per consentire l'analisi quantitativa della cromatografia liquida ad alte prestazioni con spettrometria di massa in fase inversa. Giornale di chimica agraria e alimentare. 2007;55(14):5445–5451. doi: 10.1021/jf070337l
[7] Stoyanov AV, Rogatsky E, Stein D, et al. Saggio di diluizione isotopica nella quantificazione dei peptidi: la sfida della microeterogeneità dello standard interno. Applicazioni cliniche della proteomica. 2013;7(11–12):825–828. doi: 10.1002/prca.201200130
[8] Li C, Bhavaraju S, Melanson JE, et al. Indagine sui metodi di quantificazione dei peptidi e confronto della loro riproducibilità: un caso di studio che utilizza l'ossitocina. Giornale di analisi farmaceutiche e biomediche. 2019;166:105–112. doi: 10.1016/j.jpba.2018.12.028
[9] Westwood S, Stoppacher N, Martos G, et al. Dati di riferimento dello standard interno per qNMR: acido 3,5-bis(trifluorometil)benzoico. Rapporto BIPM-2019/02, ISRD-05. Versione 1.0; 13 marzo 2019. Sezione 3. Documento di origine
[10] Cantwell H, ed. L'idoneità allo scopo dei metodi analitici: una guida di laboratorio alla convalida dei metodi e argomenti correlati. 3a ed. Eurachem; 2025. Sezioni 5.2–5.4. Documento di origine
[11] Goebel-Stengel M, Stengel A, Taché Y, Reeve JR Jr. L'importanza di utilizzare la plastica e la vetreria ottimali negli studi che coinvolgono i peptidi. Biochimica analitica. 2011;414(1):38–46. doi: 10.1016/j.ab.2011.02.009
[12] Matuszewski BK, Constanzer ML, Chavez-Eng CM. Strategie per la valutazione dell'effetto matrice in metodi bioanalitici quantitativi basati su HPLC-MS/MS. Chimica Analitica. 2003;75(13):3019–3030. doi: 10.1021/ac020361s
[13] Comitato misto per le guide di metrologia. Valutazione dei dati di misurazione: guida all'espressione dell'incertezza nella misurazione. JCGM 100:2008. Versione corretta 2010. Sezioni 4–7. Documento di origine
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