Autor Cocer Peptides          prije 26 dana.

Sažetak

Kvantitativni rezultat peptida zahtijeva definiranu kemijsku vrstu, odgovarajuću osnovu kalibracije i dokaz da rukovanje uzorkom čuva količinu koja se mjeri. Masa praha, postotak kromatografske površine i ciljana koncentracija peptida opisuju različita svojstva. Tretiranje njih kao međusobno zamjenjivih može uzrokovati pogrešku prije prvog mjerenja. Ovaj članak ispituje analizu aminokiselina, ultraljubičastu apsorbanciju, kalibriranu tekućinsku kromatografiju, masenu spektrometriju razrjeđenja izotopa i kvantitativnu nuklearnu magnetsku rezonanciju kao pristupe kvantifikaciji peptida. Objašnjava informacije koje pruža svaka metoda, pretpostavke potrebne za pretvaranje signala u količinu i kontrole potrebne za interpretabilan rezultat. Rasprava se odnosi na laboratorijske materijale i analitička rješenja. Pruža okvir za odabir i ocjenu mjernog postupka, bez propisivanja univerzalnih radnih uvjeta ili granica prihvatljivosti.

Definirajte količinu koja se mjeri

Specificirajte mjernu veličinu, što znači veličinu koju namjeravate izmjeriti, prije odabira instrumenta. Primjeri uključuju količinu intaktnog peptida u alikvotu, njegovu masenu koncentraciju u pripremljenoj otopini ili njegov maseni udio u primljenom čvrstom uzorku. Identificirajte redoslijed, grupe terminala i relevantne izmjene. Navedite uključuje li navedena masa protuione ili opisuje samo peptidni dio. Rezultat također zahtijeva definiranu granicu uzorka: otopljeni dio, cijeli preparat ili materijal prikupljen nakon određene operacije.

Izvagana krutina može sadržavati vodu, protuione, zaostala otapala i druge komponente. Veliki ciljni vrh u ultraljubičastom kromatogramu ne mjeri sve ove sastojke. Wang i kolege demonstrirali su pristup ravnoteže mase koji je kombinirao mjerenja nekoliko klasa nečistoća za karakterizaciju sintetskog peptidnog materijala. Ovo ilustrira zašto se postotak kromatografske površine ne može automatski zamijeniti masenim udjelom peptida prilikom pripreme kvantitativnog standarda. [1]

Uspostavite osnovu za kalibraciju

Kalibrator treba dodijeljenu veličinu koja odgovara mjerenju, zajedno s njezinom nesigurnošću i uvjetima pod kojima se ta dodjela primjenjuje. Provjerite potvrdu za točnu seriju, kemijski oblik, osnovu vrijednosti i upute za rukovanje. Sama naljepnica koja navodi kromatografsku čistoću ne daje ciljnu koncentraciju. Bunk i Lowenthal opisuju korištenje analize aminokiselina razrjeđenja izotopa na NIST-u za podršku dodjele koncentracije za referentne materijale za peptide i proteine. Takva dodjela zahtijeva dokumentirani postupak mjerenja, a ne nominalnu težinu praha. [2]

Za otopinu pripremljenu kvantitativno iz materijala s utvrđenim ciljanim masenim udjelom, masena koncentracija je:

ρ = m × w / V

Ovdje je m masa izvaganog materijala, w je maseni udio ciljanog peptida na istoj osnovi, a V je konačni volumen otopine. Ako je m u miligramima, w u miligramima po mililitru i V u mililitrima, ρ je u miligramima po mililitru. Izračun pretpostavlja potpuno otapanje i prijenos. Ne provjerava te operacije. Pretvorba u koncentraciju količine zahtijeva molarnu masu eksplicitno definirane kemijske vrste.

Pripremite neovisno rješenje provjere kada je to moguće. Kalibracijski standardi i provjere izvedeni iz jedne netočno dodijeljene zalihe mogu se slagati jedni s drugima dok nose istu pogrešku. Sačuvajte zapise o pripremi temeljca i razrjeđivanju kako bi se mogao rekonstruirati izvor svake dodijeljene koncentracije.

Odaberite metodu s odgovarajućom kemijskom selektivnošću

Odaberite metodu u skladu sa sastavom uzorka, očekivanom koncentracijom i nesigurnošću potrebnom za pokus. Relativno čisti referentni materijal i smjesa koja sadrži nekoliko povezanih peptida predstavljaju različite probleme mjerenja. Tablica 1 uspoređuje glavne opcije o kojima se raspravlja u nastavku. Ograničavajuće pitanje je može li se izmjereni odgovor s dovoljnom pouzdanošću pripisati definiranom cilju.

Tablica 1 Mogućnosti mjerenja i njihova glavna ograničenja

Povežite mjerenja aminokiselina s količinom peptida

Analiza aminokiselina prvo pretvara peptid u mjerljive sastavne aminokiseline. Za ostatak koji se pojavljuje ν _i puta u nizu, opažena količina n _i odgovarala bi količini peptida n _i / ν _i ako je otpuštanje potpuno i niti jedan drugi izvor nije pridonio toj aminokiselini. Usporedite procjene iz nekoliko prikladnih ostataka gdje to redoslijed dopušta. Neslaganje može otkriti problem koji bi prosjek inače sakrio.

Hidroliza mora otpustiti odabrane ostatke bez neprihvatljivog gubitka ili konverzije mjerenih aminokiselina. Bunk i Lowenthal naglašavaju da ovi uvjeti zahtijevaju validaciju za svaki analit. Muñoz i kolege procijenili su nekoliko aminokiselina pri kvantificiranju proteinskih kalibranata razrjeđivanjem izotopa, pružajući eksperimentalni primjer korištenja slaganja između procjena temeljenih na ostacima za procjenu hidrolize. Uvjeti uspostavljeni za jedan materijal ne bi se trebali smatrati odgovarajućima za različite peptide. [2,3]

Slobodne aminokiseline i drugi peptidi mogu pridonijeti hidrolizatu. Posljedično, sama analiza aminokiselina može utvrditi ukupni sadržaj povezan sa sastavom bez selektivnog kvantificiranja namjeravane intaktne sekvence. Uključite prikladne slijepe probe hidrolize i istražite te doprinose prije dodjele ciljane vrijednosti. Koristite kemijski identitet i oblik slobodne aminokiseline kada izračunavate količine kalibratora. Na primjer, PubChem identificira glicin kao CID 750; zapis baze podataka podržava provjeru identiteta, ali ne potvrđuje sadržaj referentnog materijala za aminokiseline. [4]

Interpretirajte ultraljubičasta mjerenja kroz niz

Za homogenu otopinu unutar odgovarajućeg instrumentalnog raspona, Beer–Lambertov odnos A = εlc povezuje apsorbanciju A korigiranu slijepom probom s molarnom apsorpcijom ε, duljinom optičkog puta l i koncentracijom količine c. Sposobnost upijanja mora odgovarati peptidu, valnoj duljini i uvjetima mjerenja. Apsorbancija blizu 280 nm jako ovisi o aromatskim ostacima i ne može poslužiti kao opće mjerenje koncentracije za svaki peptid. Anthis i Clore razvili su pristup temeljen na sekvenci na 205 nm, pokazujući vrijednost uzimanja u obzir sastava umjesto primjene jednog faktora konverzije. [5]

Na kraćim valnim duljinama, apsorpcija otapala i pufera može postati ograničavajuća. Upotrijebite slijepu probu koja odgovara sastavu, provjerite upotrebljivi optički raspon i usporedite prikladna razrjeđenja. Zamućenost ili apsorbirajuća nečistoća mogu proizvesti očitu promjenu koncentracije koja nije povezana s metom. Izravni rezultat apsorbancije stoga treba sadržavati pretpostavke o sastavu uzorka o kojem ovisi.

Kromatografsko odvajanje može poboljšati selektivnost prije UV mjerenja, ali kvantitativno LC ispitivanje još uvijek zahtijeva odgovarajući odnos odgovora. Kuipers i Gruppen mjerili su različite doprinose aminokiselina i peptidnih veza apsorbanciji na 214 nm. Njihovi nalazi objašnjavaju zašto jednake površine vrhova za različite peptide ne moraju predstavljati jednake količine. Za kvantifikaciju cilja, usporedite razlučeni ciljni odgovor s odgovarajućim dodijeljenim standardima i potvrdite kalibraciju u stvarnim analitičkim uvjetima. [6]

Procijenite interni standard u LC-MS razrjeđenju izotopa

U LC-MS razrjeđivanju izotopa, odgovor mete se uspoređuje s odgovorom dodanog izotopski obilježenog dvojnika kroz definirani model kalibracije. Potvrdite identitet, dodijeljenu količinu i izotopni sastav tog standarda. Ispitajte kromatografsku korespondenciju, relevantne ionske kanale i mogući doprinos neobilježenog materijala ciljnom kanalu. Stoyanov i kolege ilustrirali su kako neobjašnjena heterogenost u internim standardima peptida može utjecati na rezultirajuću ciljnu koncentraciju. Samo označavanje ne uspostavlja pouzdanu kvantitativnu referencu. [7]

Dodajte interni standard u fazi koja odgovara gubicima koje namjerava pratiti i utvrdite da se ponaša dovoljno slično analitu. Norma uvedena nakon ekstrakcije ne može ispraviti gubitke nastale tijekom te ekstrakcije. Čak i rano dodavanje zahtijeva odgovarajuće miješanje i usporedivo ponašanje. Zadržite i apsolutne odgovore i njihov omjer: stabilan omjer može prikriti velike promjene u osjetljivosti ili rukovanju uzorkom koje zaslužuju istraživanje.

Odaberite prijelaze ili signale ekstrahiranih iona koji su dokazano prikladni za cilj u matrici uzorka. Odgovarajuća vrijednost mase i naboja nije, sama po sebi, dokaz da je interferirajuća komponenta odsutna. Rezultat netaknutog peptida također se ne bi trebao pretvoriti u koncentraciju roditeljskog proteina bez zasebnog utvrđivanja odnosa probave i oporavka.

Koristite kvantitativni NMR s dodijeljenim signalima i referencama

Kvantitativni protonski NMR povezuje integrirani signal dodijeljene rezonancije s brojem jezgri koje doprinose i kvantitativnom referencom. Za interni referentni eksperiment, odnos količine može se izraziti kao:

n _x = n _r × ( I _x / N _x ) / ( I _r / N _r )

Indeksi x i r označavaju analit i referencu. I je integrirani signal, a N broj protona predstavljen tim signalom; n _r je dodijeljena referentna količina. Izraz pretpostavlja kvantitativno usporediv odziv signala i ispravnu dodjelu vrha. Pretvaranje rezultata u masu peptida zahtijeva molarnu masu na navedenoj osnovi za izvješćivanje.

Li i kolege usporedili su qNMR, analizu aminokiselina i kalibrirani HPLC u zajedničkoj studiji peptidnog referentnog materijala. Rad je pokazao praktičnu upotrebu qNMR-a i također pokazao da usporedbe metoda ovise o tome kako se tretiraju standardi i nesigurnosti. Njegovi nalazi ne uspostavljaju univerzalno rangiranje za sve uzorke peptida. [8]

Odvojite odabrani analit i referentne signale od nečistoća, otapala i međusobno. Uspostavite odgovarajuće uvjete pulsa i opuštanja, signal-šum i granice integracije. BIPM smjernice objašnjavaju zašto se opuštanje mora procijeniti za signale u stvarnoj smjesi. Referenca kemijskog pomaka nije automatski kvantitativni standard. Blisko povezane nečistoće koje dijele integriranu rezonanciju mogu pridonijeti izmjerenoj količini čak i kada je integral vrlo ponovljiv. [9]

8 Pokažite raspon kalibracije

Pripremite razine kalibracije koje pokrivaju namjeravani odgovor uzorka i procijenite odabrani model odgovora. Ispitajte ostatke i koncentracije izračunate unatrag iz krivulje. Visoki koeficijent determinacije, R², ne može sam po sebi uspostaviti prihvatljivu kalibraciju, posebno blizu donjeg kraja raspona. Eurachem preporučuje procjenu ponašanja regresije i razmatranje ponderiranja gdje se varijanca odgovora mijenja s koncentracijom. Odaberite model koristeći eksperimentalne dokaze, a ne izgled ucrtane linije. [10]

Koristite neovisno pripremljene kontrole za procjenu učinka unutar raspona. Odredite najnižu koncentraciju pri kojoj se mogu podržati potrebna preciznost i pristranost; samo otkrivanje signala nije dovoljno. Za uzorke koji zahtijevaju razrjeđivanje, pokažite da razrjeđivanje zadržava valjani rezultat. Zabilježite kriterije prihvatljivosti prije evaluacije niza uzorka i zadržite razlog za bilo koju isključenu točku kalibracije. Primijenite kriterije koji odgovaraju analitičkom cilju, bez uvoza brojčanih ograničenja iz nepovezanog testa.

Odvojite gubitke rukovanja od učinaka matrice

Ocijenite otapanje, prijenose i razdoblja zadržavanja pri koncentracijama korištenim za mjerenje. Goebel-Stengel i kolege pokazali su da oporavak peptida može ovisiti o površini koja je u kontaktu. Nezavisne pripreme uzorka pomažu otkriti ovaj doprinos, dok ponovljena mjerenja instrumenta iz iste bočice ne mogu reproducirati raniji gubitak pripreme. Usporedite odgovarajuće svježe i zadržane alikvote i istražite oporavak nakon bilo kakvog filtriranja ili čišćenja. [11]

Za LC-MS, promjena odgovora može odražavati promjenu ionizacije uzrokovanu koeluiranjem sastojaka uzorka. Matuszewski i kolege opisali su eksperimente koji razlikuju učinke matrice od oporavka ekstrakcije. Primijenjeno na peptidnu metodu, usporedbe između čistih standarda, slijepih ekstrakata obogaćenih nakon ekstrakcije i uzoraka obogaćenih prije ekstrakcije mogu pomoći u odvajanju ovih utjecaja, pod uvjetom da se dosljedno rukuje koncentracijama, volumenima i endogenim doprinosima. Procijenite normalizirani odziv unutarnjeg standarda kao i pojedinačne signale. [12]

Uključite praznine koje odgovaraju na određena pitanja. Slijepa proba reagensa ispituje uvedenu pozadinu; slijepa proba nakon koncentriranog uzorka ispituje prijenos. Tamo gdje matrica istinski praznog uzorka nije dostupna, dokumentirajte alternativni dizajn i njegova ograničenja. Šiljasti eksperiment procjenjuje oporavak dodanog materijala pod testiranim uvjetima; to ne dokazuje da je izvorno prisutan analit bio potpuno oporavljen ili bez smetnji.

Izvijestite o rezultatu s njegovom nesigurnošću i opsegom

Procjena nesigurnosti treba slijediti mjerni model i uključivati ​​utjecajne doprinose. Oni mogu proizaći iz dodjele vrijednosti kalibratora, vaganja i razrjeđivanja, oporavka pripravka, kalibracije i ponovljivosti. Uzmite u obzir zajedničke unose i korelacije gdje je relevantno. JCGM Vodič za izražavanje nesigurnosti u mjerenju daje okvir za kombiniranje takvih informacija i izvješćivanje o rezultatu. Mala standardna devijacija iz ponovljenih mjerenja opisuje samo varijaciju koju predstavljaju ta mjerenja. [13]

Navedite identifikatore uzorka i serije, definirane vrste peptida, izmjerenu količinu, jedinicu, verziju metode i osnovu kalibracije. Navedite broj i vrstu neovisnih pripravaka i kako je primijenjena korekcija razrjeđivanja ili iskorištenja. Ako je prijavljena proširena nesigurnost, identificirajte faktor pokrivenosti i tumačenje opravdano procjenom. Sačuvajte temeljne kromatograme ili spektre, odluke integracije i rezultate kontrole.

Kada se metode ne slažu, prvo usporedite njihovu kemijsku selektivnost i baze izvješća. Procjena temeljena na hidrolizatu, analiza razlučenog intaktnog peptida i masa praha mogu se odnositi na različite količine. Riješite tu razliku prije nego pripišete neslaganje izvedbi instrumenta. Korisni rezultat je količina vezana za definirani uzorak i podržana sljedivim eksperimentalnim zapisom.

Opseg istraživanja. Ovaj se članak bavi analitičkom kvantifikacijom peptidnih materijala u laboratorijskim uzorcima. Ne daje upute za ljudsku ili veterinarsku uporabu i ne navodi nikakvu tvrdnju o biološkoj učinkovitosti, kliničkoj prikladnosti ili regulatornom odobrenju. Svaki postupak mjerenja zahtijeva procjenu za namjeravani uzorak i laboratorijski cilj.

Reference

[1] Wang X, Zhang F, Li H, et al. Određivanje čistoće sintetskog glukagona korištenjem pristupa bilance mase. Znanstvena izvješća. 2020;10:4423. doi: 10.1038/s41598-020-61109-9

[2] Bunk DM, Lowenthal MS. Tekuća kromatografija s razrjeđivanjem izotopa-tandemska masena spektrometrija za kvantitativnu analizu aminokiselina. U: Analiza aminokiselina: metode i protokoli. 2. izd. Metode u molekularnoj biologiji. 2019;2030. Poglavlje 12. doi: 10.1007/978-1-4939-9639-1_12

[3] Muñoz A, Kral R, Schimmel H. Kvantifikacija proteinskih kalibranata analizom aminokiselina korištenjem masene spektrometrije razrjeđenja izotopa. Analitička biokemija. 2011;408(1):124–131. doi: 10.1016/j.ab.2010.08.037

[4] Nacionalni centar za biotehnološke informacije. PubChem Sažetak spojeva za CID 750, glicin. Pristupljeno 2. studenog 2026. Izvorni dokument

[5] Anthis NJ, Clore GM. Sekvencijalno specifično određivanje koncentracija proteina i peptida pomoću apsorbancije na 205 nm. Znanost o proteinima. 2013;22(6):851–858. doi: 10.1002/pro.2253

[6] Kuipers BJH, Gruppen H. Predviđanje koeficijenata molarne ekstinkcije proteina i peptida korištenjem UV apsorpcije sastavnih aminokiselina na 214 nm kako bi se omogućila kvantitativna analiza tekućinskom kromatografijom visoke učinkovitosti i spektrometrijom mase reverzne faze. Časopis za poljoprivrednu i prehrambenu kemiju. 2007;55(14):5445–5451. doi: 10.1021/jf070337l

[7] Stoyanov AV, Rogatsky E, Stein D, et al. Test razrjeđenja izotopa u kvantifikaciji peptida: izazov mikroheterogenosti internog standarda. Kliničke primjene proteomike. 2013;7(11–12):825–828. doi: 10.1002/prca.201200130

[8] Li C, Bhavaraju S, Melanson JE, et al. Pregled metoda kvantifikacije peptida i usporedba njihove ponovljivosti: studija slučaja s oksitocinom. Časopis za farmaceutsku i biomedicinsku analizu. 2019;166:105-112. doi: 10.1016/j.jpba.2018.12.028

[9] Westwood S, Stoppacher N, Martos G, et al. Interni standardni referentni podaci za qNMR: 3,5-bis(trifluormetil)benzojeva kiselina. Izvješće BIPM-2019/02, ISRD-05. Verzija 1.0; 13. ožujka 2019. Odjeljak 3. Izvorni dokument

[10] Cantwell H, ur. Prikladnost analitičkih metoda za svrhu: Laboratorijski vodič za validaciju metoda i srodne teme. 3. izd. Eurachem; 2025. Odjeljci 5.2–5.4. Izvorni dokument

[11] Goebel-Stengel M, Stengel A, Taché Y, Reeve JR Jr. Važnost korištenja optimalnog plastičnog i staklenog posuđa u studijama koje uključuju peptide. Analitička biokemija. 2011;414(1):38–46. doi: 10.1016/j.ab.2011.02.009

[12] Matuszewski BK, Constanzer ML, Chavez-Eng CM. Strategije za procjenu učinka matrice u kvantitativnim bioanalitičkim metodama temeljenim na HPLC-MS/MS. Analitička kemija. 2003;75(13):3019-3030. doi: 10.1021/ac020361s

[13] Zajednički odbor za smjernice u mjeriteljstvu. Vrednovanje mjernih podataka: Vodič za izražavanje nesigurnosti u mjerenju. JCGM 100:2008. Ispravljena verzija 2010. Odjeljci 4–7. Izvorni dokument

SVI ČLANCI I INFORMACIJE O PROIZVODIMA PRUŽENE NA OVOM WEB STRANICU SU ISKLJUČIVO ZA ŠIRENJE INFORMACIJA I U EDUKATIVNE SVRHE.

Proizvodi koji se nalaze na ovoj web stranici namijenjeni su isključivo in vitro istraživanjima. Istraživanje in vitro (latinski: *in glass*, što znači u staklenom posuđu) provodi se izvan ljudskog tijela. Ovi proizvodi nisu lijekovi, nisu odobreni od strane američke Uprave za hranu i lijekove (FDA) i ne smiju se koristiti za prevenciju, liječenje ili liječenje bilo kojeg zdravstvenog stanja, bolesti ili bolesti. Zakonom je strogo zabranjeno unošenje ovih proizvoda u organizam čovjeka ili životinje u bilo kojem obliku.